Описан протокол микродиссекции и последующей изоляции сердечных резидентных микрофагов путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток конкретно из синуса и AV-узла у мыши. С помощью точной микродиссекции синуса и V-узла с последующей комбинацией магнитной и флуоресцентно-активированной сортировки клеток мы можем специфически изолировать резидентные макрофаги из синуса и V узла с высокой чистотой. Выявление и выделение сердечных резидентных макрофагов из отдельных областей сердца позволяет дополнительно изучить их фенотип и регионально-специфическое влияние на электрофизиологию сердца.
После изоляции сердца выполните процедуры микродиссекции в рассеченной посуде с ледяным холодным одноразовым PBS под рассекающим микроскопом. Используйте анатомические ориентиры сердца, такие как аорта, легочная артерия, коронарный синус, а также левый или правый желудочек, чтобы определить лево-правый и передне-задний отдел сердца. После того, как ориентация определена, расположите сердце спереди на дне тарелки, чтобы обнажить задние крупные вены.
Обрежьте вдоль канавки между желудочками и предсердиями, чтобы удалить большинство желудочков. Сохраните предсердную часть. Закрепите сердце на тарелке для рассечения, вставив штифты через оставшуюся часть свободной стенки LV и LAA.
Отрежьте оставшуюся свободную стенку RV вверх через трикуспидальный клапан и верхнюю полую вену. Отверните РА и RV в сторону и закрепите РАА, чтобы обнажить межковую область полости РА и межпредсердную перегородку. Для микродиссекции SAN отрежьте сердце вдоль межпредсердной перегородки параллельно crista terminalis, чтобы отделить межковую область для получения образца SAN.
Поместите образец в пустую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду. Для микродиссекции AVN закрепите оставшиеся части сердца через ткань, прилегающую к межпредсердной перегородке и межжелудочковой перегородке, чтобы повернуться лицом к правой предсердной стороне межпредсердной перегородки вверх. Посмотрите на правое предсердие на поверхности эндокарда для треугольника Коха, который будет окаймлен спереди шарнирной линией перегородчатого листа трикуспидального клапана и сзади сухожилием Тодаро.
Отверстие коронарного синуса наблюдается у основания. Измельчите ткань SAN и AVN скальпелями. Затем добавьте 500 микролитров свежеприготовленного буфера пищеварения к каждому образцу и смойте всю измельченную ткань со стенки трубки микроцентрифуги.
Аккуратно пипетку, чтобы помочь переварить образец и гомогенизировать ткань на вихревой машине. После пищеварения перенесите тканевую суспензию в свежую 15-миллилитровую центрифужную трубку, проведя ее через 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр. Промыть клеточный ситечко дополнительными пятью миллилитрами буфера сортировки клеток, чтобы остановить пищеварение.
Удалите супернатант. После повторного использования клеточной гранулы с 90 микролитрами клеточного сортировочного буфера добавьте 10 микролитров микрогранул CD45 на 10 миллионов клеток в клеточную суспензию в 15-миллилитровой центрифужной трубке. Хорошо перемешайте образцы.
В течение времени для инкубации клеточной суспензии со смесью микрошариков и антител подготовьте набор магнитного разделения, присоединив магнитную колонну к подходящему магнитному сепаратору и затем поместив под магнитную колонну коллекторную трубку. Подготовьте магнитные колонны, промыв 500 микролитров буфера сортировки ячеек, добавленного в верхней части колонны и позволяющего буферу пройти. Нанесите суспензию ячейки непосредственно на колонку, избегая пузырьков воздуха, в то время как буфер сортировки ячеек проходит.
Трижды промыть колонну 500 микролитрами буфера сортировки ячеек. Добавьте в столбец один миллилитр буфера сортировки ячеек. Извлеките колонну из магнитного сепаратора и поместите ее на новую коллекторную трубку.
Немедленно промыть колонну, плотно применив плунжер, поставляемый с колонной, чтобы получить сквозной поток, содержащий магнитно меченые ячейки. После применения незапятнанного образца и компенсационных ламп отрегулируйте напряжение каждого канала, чтобы выровнять положительные и отрицательные пики в правильном положении оси. Установите стратегию гатинга, как описано в текстовой рукописи, используя DAPI в качестве маркера жизнеспособности.
Проверьте диаграммы проточной цитометрии, чтобы убедиться, что интересующая популяция клеток правильно показана на диаграммах. Соберите отсортированные ячейки в среду или буфер на основе необходимости последующих экспериментов. Чтобы подтвердить правильное рассечение, идентификация SAN и AVN была сделана с использованием иммунофлуоресцентного и трихромного окрашивания Массона.
Здесь показано иммунофлуоресцентное окрашивание клеток системы положительной проводимости HCN4 в SAN и AVN, а также трихромное окрашивание МАССОНОМ SAN и AVN. Стратегия сортировки клеток резидентных сердечных макрофагов помогла идентифицировать мононуклеарные клетки путем исключения дублетов в области прямого рассеяния оси Y по сравнению с областью x-оси. Мертвые клетки были исключены DAPI.
Живые клетки были закрыты для CD45 положительных лейкоцитов, а затем для CD11b-положительных миелоидных клеток. Сердечные макрофаги были идентифицированы экспрессией как F4/80, так и CD64, а затем стратифицированы экспрессией антигена лимфоцитов шесть. Свежеотсортированные клетки наблюдались при микроскопии яркого поля.
Клетки были положительными для CD45 при наблюдении под флуорофорным ПЭ-каналом. При наблюдении под флуорофором APC размером семь каналов, тот же вид отсортированных клеток показал CD11b положительные клетки. Флуорофор размером с семь каналов был использован для идентификации положительного фенотипа F4/80.
А тройные положительные клетки были идентифицированы как сердечные резидентные макрофаги. Изолированные сердечные макрофаги, культивируемые в среде до шести дней, обозначены белыми стрелками, в то время как черные стрелки указывают на мертвые клетки. Отсортированные макрофаги могут быть использованы для дальнейших функциональных исследований, таких как эксперименты с зажимом пластыря или исследования экспрессии, такие как секвенирование РНК или протеомные исследования.
