אנו מתארים פרוטוקול למיקרודיסקציה ובידוד לאחר מכן של מיקרופגים תושבי לב על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה במיוחד מסינוסים וצומת AV בעכבר. בעזרת המיקרו-דיסקציה המדויקת של הסינוס וצומת ה-V, ולאחריה השילוב של מיון תאים מגנטי ופלואורסצנטי, אנו מסוגלים לבודד באופן ספציפי מקרופאגים מקומיים מהסינוס ומצומת ה-V בטוהר גבוה. זיהוי ובידוד של מקרופאגים תושבי לב מאזורים שונים בלב מאפשר להמשיך ולחקור את הפנוטיפ שלהם ואת ההשפעה הספציפית לאזור שלהם על אלקטרופיזיולוגיה של הלב.
לאחר בידוד הלב, בצע את הליכי המיקרודיסקציה בצלחת דיסקציה עם PBS חד פעמי קר כקרח תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש בציוני דרך אנטומיים לבביים כגון אבי העורקים, עורק הריאה, הסינוס הכלילי והחדר השמאלי או הימני כדי לקבוע את השמאלי-ימני והקדמי-אחורי של הלב. לאחר קביעת הכיוון, מקם את הלב עם החלק הקדמי בתחתית המנה כדי לחשוף את הוורידים הגדולים האחוריים.
חותכים לאורך החריץ בין החדרים לאטריה כדי להסיר את רוב החדרים. שמור על החלק הפרוזדורים. הצמידו את הלב לצלחת הנתיחה על ידי הכנסת פינים דרך החלק הנותר של הקיר החופשי LV וה-LAA.
חותכים כלפי מעלה את הדופן נטולת הקרוואנים הנותרים דרך שסתום הטריקוספיד והווריד הנבוב העליון. הפוך את ה-RA וה-RV והצמד את ה-RAA כדי לחשוף את האזור הבין-קברי של חלל ה-RA ואת מחיצת הפרוזדורים. עבור microdissection של SAN, לחתוך את הלב לאורך מחיצה interatrial במקביל crista terminalis כדי להפריד את האזור intercaval כדי לקבל את דגימת SAN.
שים את הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה ריק של 1.5 מיליליטר על קרח. עבור מיקרו-דיסקציה של AVN, הצמד את החלקים הנותרים של הלב דרך הרקמה הסמוכה למחיצת הבין-פרוזדורים ולמחיצה הבין-חדרית כדי להתמודד עם הצד הימני של המחיצה הבין-פרוזדורית כלפי מעלה. התבונן באטריום הימני על פני השטח האנדוקרדיאליים למשולש קוך אשר יהיה גובל קדמית בקו הציר של עלון המחיצה של שסתום הטריקוספיד ומאחור על ידי הגיד של טודרו.
הפתח של הסינוס הכלילי נצפה בבסיס. טחנו את רקמת ה-SAN וה-AVN עם אזמלים. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ עיכול מוכן טרי לכל דגימה ושטוף את כל הרקמה הטחונה מהקיר של צינור microcentrifuge.
פיפטה עדינה כדי לעזור לעכל את הדגימה ולהומוגניזציה של הרקמה במכונת מערבולת. לאחר העיכול, העבר את תרחיף הרקמה לצינור צנטריפוגה טרי של 15 מיליליטר על ידי העברתו דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. שטפו את מסננת התאים עם חמישה מיליליטר נוספים של חיץ מיון תאים כדי לעצור את העיכול.
הסר את הסופרנטנט. לאחר החייאת גלולת התא עם 90 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים, הוסף 10 מיקרוליטרים של מיקרובידים CD45 לכל 10 מיליון תאים סה"כ לתרחיף התא בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. מערבבים היטב את הדגימות.
במהלך הזמן לדגירת ההשעיה התאית עם מיקרובים ותערובת נוגדנים, הכינו את ההפרדה המגנטית שנקבעה על ידי חיבור העמודה המגנטית למפריד מגנטי מתאים ולאחר מכן הצבת צינור איסוף מתחת לעמודה המגנטית. הכינו עמודות מגנטיות על ידי שטיפה עם 500 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים שנוספו בראש העמודה ואפשרו למאגר לעבור. החל את השעיית התא באופן מיידי על העמודה, תוך הימנעות מבועות אוויר, בזמן שמאגר מיון התאים עובר דרכו.
לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ מיון תאים. הוסף מיליליטר אחד של מאגר מיון תאים לעמודה. הסר את העמודה מהמפריד המגנטי והנח אותה על צינור איסוף חדש.
שטפו מיד את העמודה על ידי החלת הבוכנה המסופקת עם העמודה כדי לקבל את זרימת הדרך המכילה את התאים המסומנים מגנטית. לאחר החלת צינורות הדגימה והפיצוי שלא הוכתמו, התאם את המתחים של כל ערוץ כדי ליישר את הפסגות החיוביות והשליליות למיקום הנכון של הציר. הגדר את אסטרטגיית ההטיה כמתואר בכתב היד של הטקסט באמצעות DAPI כסמן כדאיות.
בדוק את תרשימי הציטומטריה של הזרימה כדי לוודא שאוכלוסיית התאים המעניינים מוצגת כראוי בתרשימים. אסוף את התאים הממוינים למדיום או למאגר בהתבסס על הצורך בניסויים הבאים. כדי לאשר כריתה נכונה, זיהוי ה-SAN וה-AVN נעשה באמצעות צביעת אימונופלואורסצנט וטריכרום של מאסון.
צביעה אימונופלואורסצנטית של תאי מערכת הולכה חיובית HCN4 ב-SAN וב-AVN, כמו גם צביעה טריכרומטית של SAN ו-AVN של Masson מוצגת כאן. אסטרטגיית המיון למיון תאים של מקרופאגים לבביים מקומיים סייעה לזהות תאים חד-גרעיניים על ידי הרחקה של כפילים באזור הפיזור הקדמי של ציר ה-y לעומת זה של ציר ה-x. תאים מתים לא נכללו על ידי DAPI.
תאים חיים היו מגודרים עבור לויקוציטים חיוביים ל-CD45, ולאחר מכן עבור תאים מיאלואידים חיוביים ל-CD11b. מקרופאגים לבביים זוהו על ידי ביטוי של F4/80 ו- CD64, ולאחר מכן רובד על ידי ביטוי אנטיגן לימפוציטים שש. תאים ממוינים טריים נצפו תחת מיקרוסקופיה של שדה בהיר.
התאים היו חיוביים ל-CD45 כאשר נצפו מתחת לתעלת PE פלואורופור. כאשר נצפתה תחת פלואורופור APC בגודל שבעה ערוצים, אותה תצוגה של התאים הממוינים הראתה תאים חיוביים CD11b. פלואורופור PE בגודל שבעה ערוצים שימש לזיהוי הפנוטיפ החיובי F4/80.
והתאים החיוביים המשולשים זוהו כמקרופאגים תושבי הלב. מקרופאגים לבביים מבודדים שגודלו בתרבית בינונית עד שישה ימים מסומנים בחצים לבנים, ואילו החיצים השחורים מציינים תאים מתים. מקרופאגים ממוינים יכולים לשמש למחקרים פונקציונליים נוספים כגון ניסויי מהדק טלאים או מחקרי הבעה כגון ריצוף RNA או מחקרים פרוטאומיים.
