Wir beschreiben ein Protokoll zur Mikrodissektion und anschließenden Isolierung von kardialen residenten Mikrophagen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung spezifisch aus Sinus und AV-Knoten in der Maus. Mit der präzisen Mikrodissektion des Sinus und des V-Knotens, gefolgt von der Kombination aus magnetischer und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, sind wir in der Lage, residente Makrophagen aus dem Sinus und dem V-Knoten in hoher Reinheit gezielt zu isolieren. Die Identifizierung und Isolierung kardialer Makrophagen aus verschiedenen Regionen des Herzens ermöglicht es, ihren Phänotyp und ihren regionsspezifischen Einfluss auf die kardiale Elektrophysiologie weiter zu untersuchen.
Nach der Isolierung des Herzens führen Sie die Mikrodissektionsverfahren in einer Dissektionsschale mit eiskaltem einmaligem PBS unter einem Seziermikroskop durch. Verwenden Sie kardiale anatomische Orientierungspunkte wie Aorta, Lungenarterie, Koronarsinus und linken oder rechten Ventrikel, um die link-rechte und anterior-posteriore des Herzens zu bestimmen. Nachdem die Orientierung bestimmt ist, positionieren Sie das Herz mit der Vorderseite am Boden der Schale, um die hinteren großen Venen freizulegen.
Schneiden Sie entlang der Rille zwischen den Ventrikeln und den Vorhöfen, um den Großteil der Ventrikel zu entfernen. Behalten Sie den Vorhofteil. Befestigen Sie das Herz an der Präzierschale, indem Sie Stifte durch den verbleibenden Teil der LV-freien Wand und die LAA einführen.
Schneiden Sie die verbleibende RV-freie Wand durch die Trikuspidalklappe und die obere Hohlvene nach oben. Drehen Sie RA und RV weg und heften Sie die RAA an, um die RA-Hohlraumregion und das Vorhofseptum freizulegen. Für die Mikrodissektion von SAN schneiden Sie das Herz entlang des Vorhofseptums parallel zum Crista-Terminalis, um die interkavale Region zu trennen, um die SAN-Probe zu erhalten.
Die Probe wird in ein leeres 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis gelegt. Für die Mikrodissektion von AVN stecken Sie die verbleibenden Teile des Herzens durch das Gewebe neben dem interatrialen Septum und dem interventrikulären Septum, um die rechte Vorhofseite des interatrialen Septums nach oben zu zeigen. Schauen Sie sich den rechten Vorhof auf der endokardialen Oberfläche für das Koch-Dreieck an, das anterior durch die Scharnierlinie des Septumblättchens der Trikuspidalklappe und posterior durch die Sehne von Todaro begrenzt wird.
Die Öffnung des Koronarsinus wird an der Basis beobachtet. Zerkleinern Sie das SAN- und AVN-Gewebe mit Skalpellen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter frisch zubereiteten Aufschlusspuffer zu jeder Probe hinzu und waschen Sie das gesamte Hackfleisch von der Wand des Mikrozentrifugenröhrchens.
Pipetten Sie vorsichtig, um die Probe zu verdauen und das Gewebe auf einer Wirbelmaschine zu homogenisieren. Nach der Verdauung wird die Gewebesuspension in ein frisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, indem Sie es durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb leiten. Spülen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen fünf Milliliter Zellsortierpuffer, um die Verdauung zu stoppen.
Entfernen Sie den Überstand. Nach Resuspendierung des Zellpellets mit 90 Mikrolitern Zellsortierpuffer werden 10 Mikroliter CD45-Mikroperlen pro 10 Millionen Gesamtzellen in die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben. Mischen Sie die Proben gut.
Während der Zeit für die Inkubation der Zellsuspension mit Mikrokügelchen und Antikörpermischung bereiten Sie das magnetische Trennset vor, indem Sie die Magnetsäule an einem geeigneten Magnetabscheider befestigen und dann ein Sammelrohr unter die Magnetsäule legen. Bereiten Sie Magnetsäulen vor, indem Sie mit 500 Mikrolitern Zellsortierpuffer spülen, der oben auf der Säule hinzugefügt wird und den Puffer passieren lässt. Tragen Sie die Zellsuspension sofort auf die Säule auf und vermeiden Sie Luftblasen, während der Zellsortierpuffer durchläuft.
Waschen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikrolitern Zellsortierpuffer. Fügen Sie der Spalte einen Milliliter Zellsortierpuffer hinzu. Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetabscheider, und legen Sie sie auf ein neues Sammelrohr.
Spülen Sie die Säule sofort, indem Sie den mit der Säule gelieferten Kolben fest anbringen, um den Durchfluss mit den magnetisch markierten Zellen zu erhalten. Passen Sie nach dem Auftragen der ungefärbten Proben- und Kompensationsröhrchen die Spannungen jedes Kanals an, um sowohl die positiven als auch die negativen Spitzen an der richtigen Position der Achse auszurichten. Legen Sie die Gating-Strategie wie im Textmanuskript beschrieben mit DAPI als Rentabilitätsmarker fest.
Überprüfen Sie die Durchflusszytometrie-Diagramme, um zu bestätigen, dass die interessierende Zellpopulation ordnungsgemäß in den Diagrammen angezeigt wird. Sammeln Sie die sortierten Zellen in Medium oder Puffer - basierend auf der Notwendigkeit nachfolgender Experimente. Um eine korrekte Dissektion zu bestätigen, wurde die Identifizierung von SAN und AVN mittels Immunfluoreszenz- und Masson-Trichromfärbung durchgeführt.
Die Immunfluoreszenzfärbung von HCN4-positiven Leitungssystemzellen im SAN und AVN sowie Massons Trichromfärbung von SAN und AVN wird hier gezeigt. Die Gating-Strategie zur Zellsortierung von residenten Herzmakrophagen half, mononukleäre Zellen durch Ausschluss von Dubletten im Vorwärtsstreubereich der y-Achse im Vergleich zur x-Achse zu identifizieren. Tote Zellen wurden durch DAPI ausgeschlossen.
Lebende Zellen wurden für CD45-positive Leukozyten und dann für CD11b-positive myeloische Zellen kontrolliert. Herzmakrophagen wurden durch die Expression von F4/80 und CD64 identifiziert und dann durch Lymphozytenantigen sechs Expression stratifiziert. Frisch sortierte Zellen wurden unter Hellfeldmikroskopie beobachtet.
Die Zellen waren positiv für CD45, wenn sie unter dem Fluorophor-PE-Kanal beobachtet wurden. Bei der Beobachtung unter Fluorophor-APC-Größe sieben Kanälen zeigte die gleiche Ansicht der sortierten Zellen CD11b-positive Zellen. Der Fluorophor-PE-Kanal der Größe sieben wurde verwendet, um den positiven Phänotyp F4/80 zu identifizieren.
Und die dreifach positiven Zellen wurden als kardiale residente Makrophagen identifiziert. Isolierte Herzmakrophagen, die bis zu sechs Tage in Medium kultiviert werden, werden mit weißen Pfeilen angezeigt, während die schwarzen Pfeile tote Zellen anzeigen. Sortierte Makrophagen können für weitere funktionelle Studien wie Patch-Clamp-Experimente oder Expressionsstudien wie RNA-Sequenzierung oder Proteomstudien verwendet werden.
