マウスの副鼻腔およびAV結節から特異的に蛍光活性化細胞選別することにより、心臓常在マイクロファージのマイクロダイセクションおよびその後の単離のためのプロトコルについて説明します。洞とVリンパ節の正確なマイクロダイセクションとそれに続く磁気活性化細胞ソーティングと蛍光活性化細胞ソーティングの組み合わせにより、副鼻腔とVノードから常在マクロファージを高純度で特異的に分離することができます。心臓の異なる領域からの心臓常在マクロファージの同定と単離により、それらの表現型と心臓電気生理学に対する領域特異的な影響をさらに研究することができます。
心臓を単離した後、解剖顕微鏡下で氷冷した1回限りのPBSを備えた解剖皿でマイクロ解剖手順を実行します。大動脈、肺動脈、冠状動脈洞、左心室または右心室などの心臓解剖学的ランドマークを使用して、心臓の左右および前後を決定します。向きが決まったら、心臓を皿の底の前部に配置して、後部の大きな静脈を露出させます。
心室と心房の間の溝に沿って切り取り、心室の大部分を取り除きます。心房部分を保管してください。LV自由壁の残りの部分とLAAにピンを挿入して、心臓を解剖皿に固定します。
残りのRVフリーウォールを三尖弁と上大静脈を通して上向きに切り取ります。RAとRVを裏返し、RAAを固定して、RA腔の隆起間領域と心房中隔を露出させます。SANのマイクロダイセクションでは、クリスタ終末に平行な心房中隔に沿って心臓を切断し、雌間領域を分離してSANサンプルを取得します。
サンプルを氷上の空の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。AVNの微小解離では、心房中隔と心室中隔に隣接する組織を通して心臓の残りの部分を固定し、心房中隔の右側を上に向けます。三尖弁の中隔リーフレットのヒンジラインによって前方に、そして後方にトダロの腱によって縁取られるコッホの三角形の心内膜表面の右心房を見てください。
冠状静脈洞の開口部は基部で観察される。SAN組織とAVN組織をメスでミンチします。次に、500マイクロリットルの新たに調製した消化バッファーを各サンプルに加え、マイクロ遠心チューブの壁からすべてのミンチ組織を洗い流します。
穏やかにピペットでサンプルを消化し、ボルテックスマシンで組織を均質化します。消化後、組織懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通して、新しい15ミリリットルの遠沈管に移します。さらに5ミリリットルのセルソーティングバッファーでセルストレーナーをすすぎ、消化を停止します。
上清を取り除きます。細胞ペレットを90マイクロリットルのセルソーティングバッファーで再懸濁した後、15ミリリットルの遠沈管内の細胞懸濁液に、総細胞1,000万個あたり10マイクロリットルのCD45マイクロビーズを追加します。サンプルをよく混ぜます。
細胞懸濁液をマイクロビーズおよび抗体混合物と共にインキュベートする時間の間に、磁気カラムを適切な磁気分離器に取り付け、次いで磁気カラムの下に収集チューブを置くことによって磁気分離セットを調製する。カラムの上部に500マイクロリットルのセルソーティングバッファーを加えてリンスし、バッファーを通過させて磁気カラムを調製します。細胞ソーティングバッファーが通過している間、気泡を避けて細胞懸濁液を直ちにカラムに塗布します。
カラムを500マイクロリットルのセルソーティングバッファーで3回洗浄します。1ミリリットルのセルソーティングバッファーをカラムに加えます。磁気分離器からカラムを取り外し、新しい収集チューブに置きます。
カラムに付属のプランジャーをしっかりと当てて直ちにカラムを洗い流し、磁気標識されたセルを含むフロースルーを得る。染色されていないサンプルと補正チューブを塗布した後、各チャンネルの電圧を調整して、正と負の両方のピークを軸の適切な位置に合わせます。DAPIを実行可能性マーカーとして使用して、テキスト原稿で説明されているようにゲーティング戦略を設定します。
フローサイトメトリーチャートをチェックして、目的の細胞集団がチャートに正しく表示されていることを確認します。選別した細胞を培地またはバッファーに回収し、その後の実験の必要性に基づいて収集します。正しい解剖を確認するために、SANとAVNの同定は、免疫蛍光とマッソンのトリクローム染色を使用して行われました。
SANおよびAVNにおけるHCN4陽性伝導系細胞の免疫蛍光染色、ならびにSANおよびAVNのマッソンのトリクローム染色をここに示します。常在する心臓マクロファージの細胞選別のためのゲーティング戦略は、y軸の前方散乱領域とx軸の前方散乱領域のダブレットを除外することにより、単核球を同定するのに役立ちました。死細胞はDAPIによって除外した。
生細胞をCD45陽性白血球についてゲーティングし、次いでCD11b陽性骨髄系細胞についてゲーティングした。心臓マクロファージは、F4/80およびCD64の両方の発現によって同定され、次いでリンパ球抗原6発現によって層別化された。新たに選別した細胞を明視野顕微鏡下で観察した。
細胞は、フルオロフォアPEチャネルの下で観察された場合、CD45に対して陽性であった。APCサイズ7チャンネルの蛍光色素下で観察した場合、選別された細胞の同じビューはCD11b陽性細胞を示した。蛍光色素PEサイズ7チャンネルを使用して、F4/80陽性表現型を同定しました。
そして、このトリプルポジティブ細胞は、心臓常在型マクロファージとして同定された。培地中で最大6日間培養された単離された心臓マクロファージは白い矢印で示され、黒い矢印は死細胞を示します。選別されたマクロファージは、パッチクランプ実験などのさらなる機能研究や、RNAシーケンシングやプロテオミクス研究などの発現研究に使用できます。
