이 프로토콜의 목적은 드로소필라 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것입니다. 이를 달성하기 위해, 우리는 이 세포의 게놈이 거의 천 번 증폭되고, 염색체는 인터페이스 세포의 특징을 보존하는 제 3 개의 인스타 애벌레의 타액 선지에서 발견되는 폴리텐 세포를 사용합니다. 그들은 잘 정의 된 텔로미어를 가지고 있으며, 모든 센트로메어가 집계되는 염색체라고 불리는 다리는 주로 이종학적입니다.
세 번째 인스타 애벌레 조직을 사용하여, 또한 우리가 다른 유전 돌연변이의 배경에 있는 이종학 골재에 있는 변경을 평가하는 것을 허용합니다. 세 번째 인스타 애벌레 문화를 최적화하려면 먼저 5~10일 의 노인을 모으고 표준 미디어의 넓은 목 병에 약 50점을 넣어야 합니다. 남성 25명, 여성 25명.
12시간 동안 25°C의 온도 인큐베이터에 병을 놓습니다. 잠복기 시간이 끝나면 성인을 제거하고 새 병으로 옮겨 절차를 반복하십시오. 배아는 22 시간 동안 섭씨 18도에서 자라고하십시오.
애벌레 컬렉션의 경우 구형이 과도하게 없는 방황하는 애벌레를 선택해야 합니다. 15쌍의 타액선 또는 감기 PBS에서 30분 동안 현미경으로 항의 억제제로 해부하십시오. 타액 땀샘을 얼음 차가운 PBS로 다른 튜브로 옮긴다.
차가운 PBS 플러스 시위 억제제로 한 번 세척하십시오. 기억, 항상 조직이 튜브의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다. 마지막 단계에서 PBS를 제거한 후 X 그룹 검 고정 버퍼 1개와 2%포름알데히드의 0.5 밀리리터를 직접 추가합니다.
가벼운 회전으로 섭씨 4도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 트리스 트리톤 버퍼로 5분 회전 세척을 수행하여 밀리리터 1개를 추가합니다. 항상 조직이 튜브의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다.
참고: 조직이 튜브 의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다. 위와 같은 트리스 트리톤과 타액 땀샘을 37도에서 2시간 동안 1%의 베타 메르카토에탄올과 함께 배양합니다. BO3 버퍼로 세척하고 BO3 + 10 밀리모어 DTT로 15 분 동안 가벼운 흔들림으로 10 밀리모어 DTT로 배양하십시오.
인큐베이션 기간이 끝나면 BO3 버퍼 1밀리리터만으로 세척을 수행합니다. 타액 땀샘을 완충 B의 1밀리리터로 배양하여 실온에서 2시간 동안 회전합니다. 모든 버퍼 B를 제거하고 버퍼 A 플러스 관심 있는 항체를 추가합니다.
이 경우, 우리는 이리듐 은행에서 HP 하나, A C 1 8 9를 사용합니다. 3에서 1, 회전과 4도에서 밤에 000. 이 시점에서 흔들림은 항체를 손상시킬 수 있는 거품을 일으키지 않는 것이 중요합니다.
버퍼 B로 15분간 세척하고, 실온에서 매번 1밀리미터를 사용하여 저어줍니다. 땀샘은 4도에서 회전하에 2 시간 동안 참조 바닥에 보조 항생제 부부와 함께 버퍼 B로 전송됩니다. 이 단계에서는 알루미늄 종이 호일로 튜브를 덮어 이차 항체를 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다.
실온에서 2x15 분 와셔를 수행하고, Sydox 또는 OH와 같은 DNA 마커가있는 완충 B.Incubate 1 밀리리터로 회전하고 회전시 실온에서 10 분 동안 완충 B의 1 밀리리터로 용해하십시오. 완충 B로 한 번 세척하고 PBS로 한 번, 각 세척은 실온에서 회전하면서 10 분 동안 지속됩니다. 마지막으로, 미끄러짐에 타액땀샘을 장착하여 덮개가 달린 수영장을 만듭니다.
침샘을 수영장 한가운데에 놓고 시디플로르로 덮습니다. 거품의 변형을 피하기 위해 점성 액체를 여기저기 확장하십시오. 그런 다음 모든 슬라이드를 명확한 매니큐어로 밀봉하십시오.
형광 또는 공초점 현미경으로 관찰하십시오. 샘플이 같은 날에 관찰되지 않을 경우 빛에서 4도에서 저장합니다. 드로소필라 살리보샘에서 HB1 단색염의 대표적인 결과가 그림 하나에 나타난다.
긍정적인 결과는 A, 체형 골재 또는 응축수와 같은 하나의 초점점을 관찰하는 것입니다. 음의 결과는 신호나 분산된 신호가 아닙니다. 때로는 이중 신호를 C의 이중 점처럼 관찰 할 수 있지만 일반적으로 소량에서 발생합니다.
데이터를 분석하려면 HP1분포를 다른 돌연변이 배경과 비교하여 막대 그래프로 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 그림 2에서, 우리는 핵의 98%가 1점의 분포를 제시하는 것을 볼 수 있다. 그리고 야생 유형의 두 초점의 2 %.
돌연변이체에서, 비율이 변경되고, 2개의 포시의 존재가 40%로 증가하여 3개의 대표적인 트리메틸레이션 리신 9H3을 모노스테인딩으로 나타낸다. B의 한 초점을 관찰하는 Drosophila 침샘의 결과, 그것은 색채 골재 또는 응축수에서 유리한 결과, C의 이중 또는 삼중 신호는 드문 경우에 볼 수 있지만, 소량. 이 프로토콜의 끝에서, 당신은 상태 제한에도 불구하고 HP1 단백질의 다이아진 응축수를 볼 수있을 것입니다, 그것은 좋은 첫 번째 접근 방식이 될 것입니다.
