O objetivo deste protocolo é visualizar agregados de heterocromatina em células de Drosophila. Para isso, usamos células de politenso que são encontradas nas glândulas salivares da terceira larva instar O genoma dessas células é amplificado quase mil vezes, e os cromossomos conservam as características das células de interface. Eles têm telômeros bem definidos, e pontes chamadas cromocentro em que todos os centrosmers agregam, e é principalmente heterocromático.
Usando o terceiro tecido larva instar, também nos permite avaliar a mudança nos agregados heterocromáticos em diferentes origens genéticas mutantes. Para otimizar a terceira cultura de larvas instar, você precisará primeiro coletar adultos de 5 a 10 dias de idade, e colocar cerca de 50 em uma garrafa de pescoço largo de uma mídia padrão. 25 homens e 25 mulheres.
Coloque a garrafa em uma incubadora de temperatura controlada a 25 graus Celsius durante 12 horas. Após o fim do tempo de incubação, remova os adultos e transfira-os para uma nova garrafa para repetir o procedimento. Deixe os embriões crescerem a 18 graus Celsius por 22 horas.
Para a coleta de larvas, certifique-se de escolher as larvas errantes, que não têm esféricos overt. Disseca 15 pares de glândulas salivares, ou o máximo que puder em 30 minutos no pbs frio com inibidores de protesto sob o microscópio. Transfira as glândulas salivares para outro tubo com PBS gelado.
Lave uma vez com PBS frio mais inibidores de protestos. Lembre-se, sempre espere o tecido chegar ao fundo do tubo. Depois de remover o PBS da última etapa, adicione diretamente 0,5 mililitros de um buffer de fixação de goma do grupo X e 50% de metanol mais 2% de formaldeído.
Incubar por duas horas a quatro graus Celsius com rotação leve. Realize uma lavagem de rotação de cinco minutos com tampão Tris-Triton, adicionando um mililitro. Sempre espere o tecido chegar ao fundo do tubo.
Nota: aguarde que o tecido chegue ao fundo do tubo. Incubar as glândulas salivares com Tris-Triton, o mesmo que acima, mais 1% de bioaptoetanol beta por duas horas a 37 graus Celsius com leve agitação. Lave com tampão BO3 e incubar com BO3 mais 10 mililitros DTT a 37 graus Celsius com leve agitação por 15 minutos.
Ao final do período de incubação, realize uma lavagem com um mililitro de tampão BO3 sozinho. Incubar as glândulas salivares em um mililitro de tampão B por duas horas em temperatura ambiente com rotação. Remova todo o buffer B e adicione o tampão A mais anticorpo de interesse.
Neste caso, usamos HP um, Um C 18 9 do banco Iridium. 1 em 3.000 durante a noite a quatro graus com rotação. Neste ponto é importante que o tremor não levante bolhas, o que pode danificar o anticorpo.
Dê o mimo por 15 minutos de lavagem com tampão B, em movimento à temperatura ambiente usando um milímetro de cada vez. As glândulas são transferidas para o tampão B juntamente com o casal de antibióticos secundários para um piso referem-se por duas horas, em rotação a quatro graus. Nesta etapa, é importante cobrir o tubo com papel alumínio para proteger o anticorpo secundário da luz.
Realizar arruelas de 2x15 minutos à temperatura ambiente, enquanto a rotação com um mililitro de tampão B.Incubar com um marcador de DNA como Sydox ou OH, e dissolver em um mililitro de tampão B por 10 minutos em temperatura ambiente com rotação. Realize uma lavagem com tampão B e uma vez com PBS, cada lavagem com duração de 10 minutos, enquanto gira à temperatura ambiente. Por fim, monte as glândulas salivares em um escorregador, fazendo uma piscina com um deslizamento de cobertura.
Coloque as glândulas salivares no meio da piscina e cubra com Sidiflor. Para evitar a deformação da bolha, estendendo o líquido viscoso por todo o lugar. Em seguida, sele todos os slides com esmalte claro.
Observe sob uma fluorescência ou microscópio confocal. Se a amostra não for observada no mesmo dia, então armazene a partir da luz a quatro graus. Os resultados representativos do monostaining HB1 nas glândulas salivares de Drosophila são mostrados na figura um.
Um resultado positivo é observar um ponto focal como em A, agregado cromático athero ou condensado. Um resultado negativo não é sinal ou sinal disperso. Às vezes, um sinal duplo pode ser observado como um ponto duplo em C, mas geralmente ocorre em quantidades menores.
Para analisar os dados, eles podem ser representadores como um gráfico de barras, comparando a distribuição do HP1 com diferentes fundos mutantes. Por exemplo, na figura dois, podemos ver que 98% dos núcleos apresentam uma distribuição de um ponto. E 2% de dois focos em tipo selvagem.
No mutante, a proporção mudou, e a presença de dois focos aumentou para 40%A figura três mostra a trimetilação representativa 9H3 em monostaining. Resulte em glândulas salivares de Drosophila observando um ponto focal em B, é um resultado favorável no agregado cromático ou condensado, um sinal duplo ou triplo em C pode ser visto em raras ocasiões, mas em pequenas quantidades. No final deste protocolo, você poderá ver um condensado diacrático de proteína HP1, apesar das limitações estaduais, será uma boa primeira abordagem.
