Este trabajo fue apoyado por una beca (R01GM098394) de los NIH y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales, así como la concesión 1.121.176 de la Fundación Nacional de Ciencia.

1. Pista A. Preparación de testículos en directo <ol><li> Preparar PBS disolviendo 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4 en 800 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4. Llevar el volumen a 1 L y esterilizar en autoclave. </li><li> Aislar testículos como se ha descrito previamente 27. </li><li> Prepare el buffer de tinción DAPI diluyendo 1 mg / ml a 1 mg / ml en PBS. Use papel de aluminio para proteger el tubo de la luz y se almacena a -20 ° C. </li><li> Después de aislar los testículos, sumergir el espécimen en 6 l de tampón de tinción DAPI en la parte superior de un portaobjetos de microscopio de vidrio cargados positivamente durante 10 min. Testículos adhieren bien a las disponibles comercialmente diapositivas cargados positivamente, lo que permite una fácil manipulación de la muestra. Diapositivas cargados positivamente son modificados de forma covalente para impartir una carga positiva estática a la superficie de vidrio. Similar al recubrimiento polilisina, esto promueve la interacción de la Wi testículosth la superficie de la diapositiva. </li><li> Lavar el exceso de DAPI mediante la sustitución del tampón de tinción dos veces con 6 l de PBS. Use un pedazo de papel de filtro para absorber y expulsar el el buffer después de cada paso de lavado. Tenga cuidado de no eliminar accidentalmente los testículos junto con el tampón durante cada lavado. </li><li> Añadir 6 l de PBS a la muestra. La cantidad de tampón usada se debe ajustar para el tamaño del cubreobjetos. Los volúmenes previstos en este protocolo son para un mm cubreobjetos de 18 x 18. Opcional: Es aconsejable para perforar los testículos cerca de la ubicación relativa del tipo de célula de interés. Esto asegurará que hay una presión mínima en estas células durante la etapa de aplastamiento, manteniendo de ese modo su integridad estructural. Perforación de los testículos se puede realizar utilizando un fuerte, escalpelo limpio. </li><li> Colocar con cuidado un cubreobjetos en la parte superior de la muestra. </li><li> Selle los bordes del cubreobjetos utilizando el esmalte de uñas transparente para asegurar que el tampón no se evapore de la muestra en vivo, mientras que imenvejecimiento. </li><li> Use un marcador para designar la posición de los testículos para la facilidad de colocar la muestra en el portaobjetos y proceder a la obtención de imágenes. </li><li> Lavar el exceso de tampón de tinción DAPI mediante la sustitución de la memoria intermedia dos veces con 6 l de PBS. Use un pedazo de papel de filtro para absorber y expulsar el el buffer después de cada paso de lavado. Tenga cuidado de no eliminar accidentalmente la muestra junto con el tampón durante cada lavado. </li></ol> 2. Track B. Preparación de Testículos fijos <ol><li> Prepare el buffer Fix diluyendo una solución de formaldehído de stock del 37% en PBS a una concentración final de 3,7% de formaldehído en PBS 1x </li><li> Prepare el buffer de tinción DAPI diluyendo 1 mg / ml DAPI acciones a 1 g / ml en PBS. </li><li> Sumergir los testículos en un 6 l gota de PBS en la parte superior de un portaobjetos de microscopio de vidrio cargados positivamente. </li><li> Orientar manualmente los testículos en forma lineal o según lo recomendado. </li><li> Use un pedazo de papel de filtro para absorber la PBS y reemplazarlo con 6 l de Fixtampón durante 5 min. </li><li> Use un pedazo de papel de filtro para absorber la del búfer Fix y sumergir la muestra en 6 l de tampón de tinción DAPI durante 10 minutos. </li><li> Colocar con cuidado un cubreobjetos de 18 mm x 18 en la parte superior de la muestra. </li><li> Selle los bordes del cubreobjetos utilizando el esmalte de uñas transparente para asegurar que el tampón no se evapore de la muestra mientras que las imágenes. </li><li> Use un marcador para designar la posición de los testículos para la facilidad de colocar la muestra en el portaobjetos y proceder a la obtención de imágenes. </li></ol> 3. Track C. Preparación de inmunotiñeron Testículos Siliconación Cubreobjetos: Sumergir múltiples cubreobjetos de 18 x 18 mm en una pequeña bandeja que contiene solución siliconado y se incuba durante 1 min a temperatura ambiente en una campana de humos. Asegúrese de que los cubreobjetos están completamente expuestas y no se apilan en la parte superior de cada otra. <ol><li> Colocar la muestra en un 5 l gota de PBS sobre el cubre siliconada. Oriente eltestículos como se desee y perforar los testículos con un bisturí afilado. Colocar suavemente un portaobjetos de microscopio de vidrio cargados positivamente sobre el cubreobjetos, permitiendo que el PBS para ser uniformemente dispersa entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Use un pequeño trozo de papel de filtro para absorber el exceso de amortiguación entre el cubreobjetos y portaobjetos. Como se quita el tampón por el papel de filtro, el aumento de la presión se aplastar los testículos. Muchas muestras deben ser preparadas de forma simultánea, ya que algunos pueden ser perdidos o dañados en el transcurso del protocolo. Un grabador de vidrio se puede utilizar para etiquetar los portaobjetos si se prepararon diferentes tipos de muestras simultáneamente. <ol><li> Lavar el cubreobjetos de 3x durante 1 min cada uno en agua, seguido de 3x durante 1 min cada uno en etanol al 70%, y un lavado final durante 1 min en agua. Permitir los cubreobjetos siliconados se sequen al aire en una campana de humos. </li></ol></li><li> Suelta las diapositivas en nitrógeno líquido y se permiten las muestras se congelen durante 5-10 min. </li><li> Retire los portaobjetos de la liquid de nitrógeno utilizando un gran fórceps. Utilice un bisturí para eliminar rápidamente el cubreobjetos. La muestra debe permanecer en la diapositiva. Tenga cuidado de no manchar la muestra durante este proceso deslizando el cubreobjetos lo largo de la diapositiva. </li><li> Incubar los portaobjetos en metanol preenfriado en un frasco de Coplin de tinción de vidrio a -20 ° C durante 15 min. </li><li> Transfiera los portaobjetos a una cubeta de tinción Coplin de vidrio que contiene acetona previamente enfriado a -20 ° C durante 30 segundos. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 1 min en PBS a temperatura ambiente usando una tinción vaso de Coplin de vidrio. </li><li> Preparar PBST-B completándolo PBS con 0,1% de Triton-X100 al 1% y albúmina de suero bovino (BSA). 5% de suero normal de la misma especie hospedadora que el anticuerpo secundario (de la etapa 3.14) puede ser utilizado en lugar de BSA para reducir el ruido de fondo producido a partir de anticuerpo secundario unión no específica. </li><li> Incubar los portaobjetos durante 10 minutos en PBST-B en un frasco de vidrio para tinción Coplin para bloquear los sitios no específicos. </li><li> Llenar los pozos dela cámara de humedad con agua. Humedad dentro de la cámara reducirá al mínimo la evaporación de soluciones de anticuerpo de la muestra durante los pasos de incubación. </li><li> Preparar PBST-BR completándolo PBST-B con 100 g / ml de RNasa A. RNasa A degrada el ARN en la muestra y también sirve como un agente de bloqueo adicional al absorber fuertemente a la superficie de vidrio. <ol><li> Coloque una pieza de aproximadamente 1x1 cm de Parafilm en la parte superior de la muestra para separar la solución de anticuerpo de manera uniforme y proteger la solución de anticuerpos de evaporación. Cierre de la cámara de humedad e incubar la muestra en el anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Retire los portaobjetos de la SAFT-B. Utilice un trozo de papel de filtro para secar la zona de la corredera alrededor de la muestra, usando precaución para no secar el espécimen mismo. Por último, colocar la placa en la cámara de humedad con el espécimen hacia arriba </li><li> Añadir suavemente 100 l de anticuerpo primario diluido en PBST-BR en la parte superior de la especificaciónimen (1:200 es generalmente una buena concentración de partida de anticuerpos no caracterizados). <ol><li> Cubra la muestra con un aproximadamente 1 x 1 cm unidad de Parafilm y cerrar la cámara de humedad. Incubar la muestra en anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Abra la cámara de la humedad y el uso de fórceps para quitar suavemente el Parafilm de la diapositiva. Incubar los portaobjetos durante 5 minutos en PBST en una jarra de Coplin tinción de vidrio a temperatura ambiente para lavar. Repita este proceso para un total de tres lavados. </li><li> Retire los portaobjetos de la SAFT-B y colocarlos en la cámara de humedad con el espécimen hacia arriba. Añadir suavemente 100 l de anticuerpo secundario diluido en PBST-BR en la parte superior de la muestra. </li><li> Abra la cámara de la humedad y el uso de fórceps para quitar suavemente el Parafilm de la diapositiva. Una vez más, se lava la 3x espécimen durante 5 minutos cada uno en PBST en un frasco de vidrio de tinción Coplin seguido de 3x durante 5 minutos cada uno en PBS. </li><li> Utilice un Kimwipe y papel de filtro para<html> secar cuidadosamente la superficie de la diapositiva, teniendo cuidado de evitar tocar o secado de la muestra. </li><li> Añadir 6 l de medio de montaje de espécimen, tapar con un cubreobjetos limpio (no recubierto con silicona), y el sello de los bordes con esmalte de uñas. </li><li> Use un marcador para designar la posición de los testículos para la facilidad de colocar la muestra en el portaobjetos y proceder a la obtención de imágenes. </li></ol> 4. Imaging Notes Imaging se puede lograr utilizando un microscopio de luz normal en posición vertical o invertida o un microscopio confocal. Es importante que el microscopio se equipa de contraste de fase, especialmente para la obtención de imágenes de los testículos en vivo especímenes (pista A). Esta característica se ha convertido recientemente disponible en microscopios confocal. Cuando los testículos se rompen espontáneamente (pista A), la punta (tallo región celular) generalmente se mantiene intacta y es fácilmente identificable, proporcionando un buen marcador para localizar la fuente y utilizar para la orientación. _content &quot;&gt; Los centríolos son estructuras relativamente pequeñas y por lo tanto, las imágenes deben tomarse usando 63X o 100X objetivos, un factor de zoom de 4-6X, y una resolución mínima de 512 x 512 píxeles cuando sea posible.

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El libre acceso a esta publicación fue apoyada por Leica Microsystems.

El estudio de la biología del centrosoma en los testículos de la mosca utilizando marcadores centrosomal genéticamente etiquetados-es un método útil para evaluar la función y la actividad del centrosoma en un contexto tanto de tipo salvaje y mutante. En particular, pista A es adecuado para la detección rápida de anomalías centrosomales tales como malformación, misegregation, inestabilidad, o la longitud anormal en un esfuerzo para identificar nuevos mutantes. Además, los cilios espermátide en preparaciones en vivo conservaron la movilidad durante aproximadamente 15 min después de la disección y el uso de los testículos en vivo en la canción A también permite la motilidad de los espermatozoides para ser fácilmente dirigida. Dado que la actividad de los espermatozoides cilios móviles está directamente relacionada con la función del centrosoma, ensayos se pueden realizar para determinar los efectos de diversas mutaciones centrosomales sobre la función ciliar. Pista B se puede utilizar para las observaciones más específicas, especialmente cuando se necesitan datos estadísticos tales como para contar el número de centríolos por célula y o el número de células por quiste. Track C es más useful para observaciones detalladas que requieren tinción con anticuerpos. Los ejemplos incluyen el etiquetado de un determinado tipo de células, como las células madre, la tinción de una proteína que no tiene una etiqueta disponible, como la tubulina acetilada, o para comprobar la ausencia o mislocalization de una proteína en un mutante. Al obtener imágenes centrosomas y estructuras relacionadas centrosoma, utilizando marcadores genéticamente con etiquetas en lugar de anticuerpos no sólo experimentalmente más fácil, pero también proporciona resultados más robustos y reproducibles. Por lo tanto, el uso de proteínas centrosomal genéticamente etiquetados-es un enfoque fiables para los análisis mecanicistas y cuantitativos que requieren un conjunto de datos de gran tamaño. Por ejemplo, el uso de marcadores centrosomales genéticamente etiquetados-ha sido particularmente valiosa para la cuantificación de la longitud del centríolos. Este análisis ha puesto de manifiesto que diversas mutaciones se pueden clasificar en dos categorías basadas en la variabilidad de longitud centríolos. Una categoría incluye mutaciones que ChanGE longitud centriolo pero no afectan a la desviación estándar 1 y la otra categoría incluye mutaciones que afectan tanto a la longitud centriolo y la desviación estándar de longitud 11. Tales datos cuantitativos pueden proporcionar información útil sobre la función de genes particulares centrosomal. Centrosomales mutantes que exhiben longitud centriolo defectuoso con un aumento en la desviación estándar puede ser debido a una desestabilización de la estructura centriolar. Sin embargo, la longitud centriolo defectuoso con un error estándar normal puede indicar que la mutación no desestabiliza el centriolo estructuralmente y es más probable que sea debido a un cambio en el mecanismo de regulación que controla la longitud centríolos. Debido a las inconsistencias en la inmunotinción, análisis cuantitativos son difíciles con el uso de marcadores de anticuerpos solo. El centrosoma es una estructura proteica grande, compleja y muchas de sus proteínas sólo se encuentran en su interior. Usando centrosomal genéticamente con etiquetasmarcadores más bien los anticuerpos permite a uno para etiquetar consistentemente componentes internos del centrosoma cuyos epítopos pueden ser de otra manera inaccesibles para los marcadores de anticuerpos. Por ejemplo, los estudios de localización de BLD10 utilizando anticuerpos encuentra la proteína a ser enriquecido en los extremos distal y proximal de la centriolo 13, mientras que BLD10-GFP muestra una distribución más uniforme 1. Sin embargo, también es importante considerar el nivel de expresión de una proteína genéticamente-etiquetados en particular, ya que esto puede afectar a la distribución de proteínas. La localización de Sas-4-GFP y SAS-6-GFP expresada bajo su endógena se limita a los extremos proximales de la centriolo 1,16,35 Por otro lado, Sas-4-GFP y SAS-6-GFP expresado bajo el fuerte promotor de la ubiquitina se localizan a lo largo de toda la longitud de la centriolo 12,14. Otra consideración importante es el efecto de la etiqueta genética en función de la proteína. Analizar si las proteínas genéticamente etiquetados-son funcionales puede ser tested mediante la introducción de la proteína transgénica en un mutante de fondo y examinar si la proteína transgénica rescata el fenotipo mutante. Fijación de los testículos de Drosophila se puede realizar utilizando una variedad de fijadores químicos. Aquí se describe la fijación con tanto formaldehído (Área B) y metanol-acetona (Ciclo C). Sin embargo, ya sea fijador se puede utilizar de forma intercambiable y desde diversos fijadores pueden alterar químicamente epítopos de anticuerpo nativo, la selección del fijador apropiado para la inmunotinción se debe determinar experimentalmente. Los siguientes fijadores y condiciones de incubación son comúnmente empleadas: 3,7% de formaldehído, 5 min a temperatura ambiente; metanol, 15 min a -20 ° C; acetona, 10 min a -20 ° C; metanol, 15 min a -20 ° C. seguido de acetona, 30 segundos a -20 ° C; etanol, 20 min a -20 ° C. Aunque la fijación con acetona, metanol, etanol y no requieren un paso de permeabilización extendida para la inmunotinción, WI fijaciónª formaldehído debe ser seguido por una incubación de 1 hora en PBST-B a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares y permitir el acceso del anticuerpo a epítopos intracelulares. Además, ciertos fijadores son más adecuados para antígenos particulares. Por ejemplo, las funciones de formaldehído bien para la fijación de las proteínas pequeñas, mientras que el metanol y acetona son muy adecuados para la fijación de grandes complejos moleculares 36. La inmunotinción de Drosophila testículos se ha descrito anteriormente para la observación de estructuras de la cromatina y el citoesqueleto de microtúbulos 29,37. Aquí (Ciclo C), el procedimiento ha sido optimizado para el análisis de estructuras centrosomal contienen proteínas genéticamente etiquetados. Proporcionamos una descripción detallada de este procedimiento para guiar a las personas que no tienen experiencia en trabajar en los testículos de Drosophila. Este procedimiento también incluye modificaciones para mejorar la conservación y la morfología de los testículos, tales como mediante el uso de siliconized cubreobjetos y portaobjetos de vidrio con carga positiva.

Testículos de Drosophila son un sistema de órgano adecuado para estudiar una variedad de procesos celulares y de desarrollo y se han revisado ampliamente en los años 1-9. Este manuscrito se centra en el uso de los testículos de Drosophila para estudiar el centrosoma, un orgánulo celular conservada. Al igual que en otros sistemas, el centrosoma de los testículos función de Drosophila en la mitosis, meiosis, y ciliogenesis 10. Los centrosomas se componen de un par de estructuras a base de microtúbulos conocidos como centriolos rodeados por una red compleja de proteínas que se refiere al material como pericentriolar (PCM). El par de centríolos se compone de un centríolo madre mayor y un centríolo hija menor. A medida que la célula progresa hacia la mitosis, ambos centriolos se separan, por duplicado, y adquirir una gran cantidad de PCM que finalmente forman dos centrosomas distintas. El centrosoma que contiene el centríolo madre original se conoce como el centrosoma madre y el CentrOsome que contiene el centríolo hija original se conoce como el centrosoma hija. Testículos de Drosophila son ideales para el estudio de las bases moleculares de la biología del centrosoma por microscopía de fluorescencia para una variedad de razones. <ol><li> La mayoría de las proteínas de Drosophila que se requieren para la biología del centrosoma en los testículos se conservan entre los eucariotas, lo que sugiere que visión relevante a la biología del centrosoma en los seres humanos y otras especies puede ser adquirida mediante el estudio de la centrosoma en Drosophila testículos 1,11-14. </li><li> Realización de análisis de mutantes en Drosophila proporciona una ventaja significativa ya que, a diferencia de muchos otros modelos, las mutaciones centrosomal en Drosophila no son embriones letal, lo que permite el análisis genético clásico de la función del centrosoma. Esta característica única de Drosophila es debido a la presencia de la contribución maternal que persiste durante las etapas críticas de desarro embrionario. pment 1,11-14. Por lo tanto, se puede a) mutaciones de estudio que eliminan completamente la formación del centrosoma y b) estudiar el destino de un centrosoma normal que se forma en el embrión temprano por la contribución materna en un contexto mutante después de la contribución materna se ha agotado (el principio del método se describe en 11). </li><li> Transgenes funcionales con etiquetas fluorescentes codificadas genéticamente que etiquetan el centrosoma están disponibles. Muchas de estas líneas uso propio promotor de la proteína para conducir la transcripción del transgén con el fin de evitar una fuerte sobreexpresión. Esto es particularmente importante porque la sobreexpresión de proteínas a menudo resulta en artefactos que interfieren con el análisis de la función del centrosoma 1,11. </li><li> El centríolo y centrosoma son excepcionalmente largos a lo largo de Drosophila espermatogénesis, permitiendo de este modo para el análisis rápido y fácil de la centrosoma mediante formación de imágenes. </li><li> Pasos consecutivos en la espermatogénesis y centrosoma biology están organizados cronológicamente a lo largo de los testículos, a partir de la punta testículos con los centrosomas de las células madre de esperma y terminando en la parte inferior de los testículos con una reducción en el tamaño del centrosoma y la actividad en las células espermáticas maduras (Figuras 1 y 2). Esto permite una fácil identificación y el análisis de la función del centrosoma durante las diferentes etapas de desarrollo de los espermatozoides. </li><li> Los testículos son fácilmente disecados de larvas macho, pupas y adultos 27. </li><li> Durante la espermatogénesis, el centrosoma y sus centríolos proceder a través de composición múltiple, estructural y funcional de los estados para que funcionen en la mitosis, meiosis, y la formación de los cilios. Durante estos procesos, los ensambla centrosoma, duplicados, migra, anclajes a partes específicas de la célula, madura, divide y crea un cilio. Además, el centriolo de la espermátide madura da lugar a un precursor centriolar llamado el PCL 1. También en el espermátide maduro, el centrosoma se somete a un proceso de called reducción centrosoma mediante la cual pierde muchos componentes de la PCM y el centriolo (Figuras 1 y 2). Por lo tanto, los estudios en los testículos permiten uno para atender múltiples aspectos de la vida centrosoma como la retención del centrosoma en las células madre, la duplicación centríolo, estabilidad centríolo, elongación centríolo, separación centríolo y la segregación, la contratación PCM, ciliogenesis, formación de PCL, la reducción del centrosoma, y astral nucleación de microtúbulos entre otros. </li><li> Por último, los estudios de la biología del centrosoma son ayudados por las demás características bien conocidas de Drosophila que han hecho un organismo modelo preferido para estudios biológicos. Estos incluyen un tiempo de generación corto, la facilidad de la genética, así como mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio. </li></ol> En conjunto, las características arriba indicadas de Drosophila testículos proporciona un modelo en el que el centrosoma se puede estudiar por imágenes de fácil, rápida y detallada. Las técnicas descritasen este trabajo se han aplicado a investigar muchos aspectos de la biología del centrosoma, incluyendo la formación centríolo 11, duplicación centríolo 15, el reclutamiento PCM 16, regulación centrosoma 17 y ciliogenesis 18. Estas técnicas también se han aplicado para estudiar el centrosoma en otras áreas de la biología, tales como la regulación meiótica 19, conjunto de husillo 20, y la actividad del centrosoma en la división de células madre asimétrica 21 entre muchos otros. Imágenes de los testículos en los arranques centrosoma con la obtención de las moscas que expresan proteínas centrosomal genéticamente etiquetados y aislar los testículos de larvas macho, pupas o moscas adultas. Estas moscas son disponibles a partir de varios grupos de investigación 1,11,15,22-25. Los testículos contienen larvas de todas las etapas de la espermatogénesis antes de la meiosis y son útiles en el análisis de las mutaciones que son letales en la pupa o adulto. Sin embargo, pupa Tarde o jóvenes adult testículos son las más robustas y contienen todos los pre-y post-meióticas etapas de la espermatogénesis, con lo que serían preferibles para su análisis. Dado que el número de células de esperma disminuye a medida que las edades de la mosca, el uso de los testículos adultos también es apropiado para el estudio de la centrosoma en el contexto del envejecimiento. 26. Un método de aislamiento testículo de moscas adultas se ha descrito previamente 27. Imágenes de centrosomas y su función en los testículos de Drosophila se puede lograr a través de tres vías relacionadas que se presentan aquí (Figura 3). La selección de la pista que es el más apropiado depende de la naturaleza de la pregunta del investigador está abordando. Track A implica imágenes de los testículos en vivo. Es el más rápido de los tres temas, pero sólo se puede aplicar cuando las muestras no necesitan ser preservados y no es necesario si la inmunotinción. En la pista A, los testículos están montados (intacta, traspasado o corte) en las diapositivasy cuidadosamente aplastado bajo un cubreobjetos para formar una sola capa de células fácilmente identificables. Las células se visualizaron utilizando tanto microscopía de contraste de fases y microscopía de fluorescencia. El uso de contraste de fase es particularmente importante para el análisis de los testículos de Drosophila porque revela información celular que no es visible con otras formas de iluminación transmitida y por lo tanto permite la identificación rápida de diferentes etapas de desarrollo de los espermatozoides 28,29. Sin embargo, la pista A tiene dos desventajas principales. En primer lugar, la integridad morfológica de las células se compromete a menudo una vez se rompen los testículos. En segundo lugar, las células no fijadas a veces se mueven dentro de la muestra, por lo que la obtención de imágenes de múltiples capas confocal dentro de una región determinada difícil. Para promover el análisis de tipos de células específicas, testículos pueden ser perforados o cortados con el fin de dirigir la forma en que las rupturas de testículo de tal modo que el aplastamiento bajo el cubreobjetos mínimamente afecta a la morfología del tipo celular de interés. Track B implica la fijación química de los testículos. Esta pista requiere una cantidad intermedia de tiempo para la preparación de la muestra y tiene la ventaja de que las muestras fijadas se pueden guardar para su posterior análisis. Además, la fijación sirve para hacer estructuras celulares más rígida, lo que minimiza el movimiento de la muestra durante la formación de imágenes. Sin embargo, la microscopía de contraste de fase se convierte en mucho menos informativo después de la fijación química, por lo que algunas etapas de desarrollo difíciles de identificar espermatozoides. Pista C es la más intensiva de tiempo, pero tiene la ventaja añadida de que las estructuras celulares son fijos y inmunotiñeron, lo que permite la visualización de las proteínas que no están disponibles con las etiquetas de genética apropiadas. Hay muchos anticuerpos disponibles comercialmente y de varios grupos de investigación para la inmunotinción centrosomas y estructuras relacionadas centrosoma en los testículos de Drosophila.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/ Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments/Description</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1306</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positively Charged Slides</td>
 <td>AZER Scientific</td>
 <td>EMS200A+</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feather Microscalpel</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72045-30</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37% Formaldehyde or Paraformaldehyde</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP531-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
 <td>Boston Bioproducts</td>
 <td>BM-220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18x18 mm coverslips number 1.5</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48366 205</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nail Polish</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72180</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A412-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A949-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton-X100</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T9284-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Jackson ImmunoResearch</td>
 <td>001-000-162</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse A</td>
 <td>5 prime</td>
 <td>2900142</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter paper</td>
 <td>Whatman</td>
 <td>1001-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass engraver</td>
 <td>Dremel</td>
 <td>290-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCS SP5 confocal microscope</td>
 <td>Leica </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounting Media</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>17985-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immuno Stain Moisture Chamber, Black</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62010-37</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70315</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

imaging centrosomes in fly testes

Los centrosomas se conservan orgánulos a base de microtúbulos cuya estructura y el cambio de forma espectacular durante todo el ciclo celular y la diferenciación celular de función. Los centrosomas son esenciales para determinar el eje de la división celular durante la mitosis y para nuclear cilios durante la interfase. La identidad de las proteínas que median estos cambios dinámicos sigue siendo sólo parcialmente conocida, y la función de muchas de las proteínas que han sido implicados en estos procesos es todavía rudimentaria. Trabajos recientes han demostrado que la Drosophila espermatogénesis proporciona un sistema eficaz para identificar nuevas proteínas críticas para la función del centrosoma y la formación, así como para comprender mejor la función particular de los jugadores conocidos en los procesos relacionados con el centrosoma. Drosophila es un organismo establecido modelo genético donde los mutantes en los genes centrosomales se pueden obtener fácilmente y analizar fácilmente. Por otra parte, los recientes avances en la sensibilidad y la resolución de la microscopía de luz y ladesarrollo de robustos marcadores centrosomales etiquetados genéticamente han transformado la capacidad de utilizar testículos de Drosophila como un sistema de modelo simple y accesible para estudiar los centrosomas. Este artículo describe el uso de marcadores centrosomal genéticamente etiquetados-para realizar cribados genéticos para los nuevos mutantes centrosomal y para obtener una perspectiva de la función específica de los genes recientemente identificados.

Los centrosomas se someten a múltiples transformaciones morfológicas y funcionales en el transcurso de la espermatogénesis. Esta característica de espermatogénesis hace que los testículos de un sistema útil para estudiar diversos aspectos de la biología del centrosoma. Uno de tales procesos es observado fácilmente alargamiento centrosoma. En espermatogonias, el marcador centriolar Ana1-GFP marca el 0,6 micras de largo centríolo (Figura 4a). Esta centríolo se alarga durante la espermatogénesis y alcanza una longitud de 2,5 micras de espermátidas casi maduros. Desde centríolos en Drosophila espermatozoides son excepcionalmente largos, de formación de imágenes puede ser utilizado para hacer afirmaciones cuantitativas respecto a la elongación centrosoma (Figura 4b). Análisis de la longitud del centríolo también se puede realizar en un fondo mutante y varios mutantes han sido identificados que altera el crecimiento centriolo (Figura 5). Ejemplos son siempre temprano (aly) y Cannonball (CAN), mutaciones que arrest espermatogénesis antes del inicio de la meiosis 30 pero no bloquean la elongación centríolo. En estos mutantes, centríolos de la espermatocito madura crecen a alrededor de ~ 2,4 m en comparación con centríolos de las células de control que llegan a un máximo de 1,8 m. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1highres.jpg"/> Figura 1. La espermatogénesis y Biología Centrosoma. A) El desarrollo de las células madre y espermatogonias. Todas las células de esperma se originan a partir de células madre que se encuentran en el extremo apical de los testículos. Cada célula madre se divide asimétricamente para formar una célula madre que hereda el centrosoma madre y un spermatogonium progenitor que hereda el centrosoma hija 31. Como forma Espermatogonias, se convierten rodeados de 2 células del quiste, que siguen rodeando los espermatocitos y espermátidas en toda la espermatogénesis. Espermatogonias dividir 4 veces para producir 16 Espermatogonias, cada uno con dos centriolos. B) Desarrollo de espermatocitos y meiosis. Durante el desarrollo de espermatocitos, centríolos se duplican una vez más para generar cuatro centríolos organizados en dos pares por célula y 64 centríolos por quiste. Temprana durante el desarrollo de espermatocitos, cada centríolo mueve a la membrana plasmática, muelles a ella, y se alarga para formar una estructura que se asemeja a un cilio primario 18,32-34. En maduros espermatocitos, longitud centríolo alcanza ~ 1.8 micras. Los centrosomas juegan un papel esencial en la meiosis. Durante la meiosis I, los pares de centríolos que todavía están unidos a la membrana plasmática movimiento hacia el centro de la célula y crean invaginaciones de la membrana celular en su punta distal. El PCM alrededor de los centríolos crece, nuclea microtúbulos astrales, y colocalizes con el polo del huso. Durante la transición a la meiosis II, el par de centríolos separa de manera que se presen solo un centríolot en cada polo del huso. C) Espermiogénesis. Al final de la meiosis II, los primeros redondo en espermátidas tiene un solo centríolo unido a la membrana plasmática invaginado. Una gran ronda derivado mitocondrial se encuentra cerca del núcleo y más tarde comienza a alargarse a lo largo de la creciente axonema en posteriores espermátidas redondas. Durante la espermatogénesis, las formas axonema y se alarga en el interior del citoplasma. Además aparece una nueva estructura centriolar conocido como el PCL (proximal Centriolo Like) cerca del centríolo preexistentes 1. Al final de la espermatogénesis, las células que comparten un quiste común separan unos de otros para convertirse en espermatozoides móviles totalmente madura. Los diagramas de desarrollo espermatocito (B) y Espermiogénesis (C) representan sólo una célula de los 16 espermatocitos y 64 Espermátidas, respectivamente por un quiste, y no representan las células quiste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50938/50938fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver en grande</a>r figura. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2highres.jpg"/> Figura 2. Los testículos Drosophila. Una superposición de un contraste de fase y fluorescencia GFP micrografía de un testículo todo el montaje que expresa el marcador pan-centriolar Ana-1-GFP. Área distinta corresponden a los paneles 1-3 de la Figura 1 están separadas por una línea roja discontinua A) Células madre y espermatogonias, B) Los espermatocitos y Meiosis, C) Espermiogénesis. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3highres.jpg"/> Figura 3. Pistas Hacia Imaging centrosomas en Drosophila testículos. <p class="jove_content" fo: Páginas together.within-keep = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4highres.jpg"/> Figura 4. Centrosoma Alargamiento durante la espermatogénesis. A) Cada etapa muestra una imagen de contraste de fase (izquierda), imagen de fluorescencia (en el centro), y la imagen ampliada del centrosoma (derecha). La imagen de contraste de fases demuestra la etapa de célula particular, basándose en la posición y la morfología de la célula, núcleo, nucleolo, y las mitocondrias. La imagen muestra la fluorescencia de ADN teñido con DAPI (azul). La imagen muestra centrosoma centrosomas etiquetados por Asterless-GFP (Asl, imágenes superiores) y Ana1-GFP (Ana1, imagen inferior). Un círculo blanco destaca la membrana celular en las dos imágenes de contraste de fase y fluorescencia. Los círculos blancos de trazos y el círculo gris en la imagen de fluorescencia resaltar la posición del núcleo y el nucléolo, respectivamente. Amarillo flecha señala el Y-cromosomaalgunos bucles. Rojo discontinuo círculos marcan la mitocondria. Etapas 1-6 se refiere a 29 y 13 a 17 etapas se refiere a la descripción de las etapas de células en el 32. Etapa 1: espermatocito primario. Identificada como una pequeña celda de una punta del testículo. Etapa 2a: Polar espermatocito. Identificada por la presencia de una tapa de mitocondrias en un lado del núcleo. Etapa 3: Apolar espermatocito. Identificado por su relativa tamaño mayor que el de espermatocitos primarios y la falta de una tapa de mitocondrias. Etapa 4: espermatocito primario. Identificado por la aparición de todo: de los 3 bucles del cromosoma. Etapa 5: espermatocito primario maduro. Espermatocito más grande producido en la espermatogénesis, identificado por un aumento adicional en el tamaño nuclear. Etapa 6: premeiotic espermatocito primario. Bucles del cromosoma Y se desintegran y el núcleo desaparece. Etapa 13: Cebolla Etapa espermátidas. Células redondas que contiene el núcleo del mismo tamaño y las mitocondrias. Etapa 17: Late espermátide. Identificado como un espermátide alargada que sigue siendo parte de un bundle de 64 espermátidas con núcleos que se encuentran cerca de la base de los testículos., núcleos son ligeramente más ancho que espermátidas maduras se encuentran en la vesícula seminal. Las barras de escala, 10 micras y 1 micra. B) Gráfico representa promedio y desviación estándar para cada etapa, medida por Asterless-GFP (azul) y Ana1-GFP (verde). En la Etapa 6, (verde) los promedios y las desviaciones estándar Asterless-GFP (azul) y Ana1-GFP se superponen y sólo Asterless-GFP (azul) es evidente. A partir de la etapa 13, Asterless-GFP no decorar todo el centríolo y las mediciones no fueron determinadas (ND). <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5.jpg" alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5highres.jpg"/> Figura 5. Anormalmente largas centríolos en la Etapa 6 espermatocitos de aly y ¿pueden los mutantes. AC) Microfotografía de luz de testículos enteros y el panel fluorescente del representante centrosoma labeled por Ana1-GFP. Tenga en cuenta la forma anormal de los testículos en aly y puede mutantes, que resulta de la falta de espermátidas como consecuencia de la detención meiótica. D) Gráfico representa la desviación media, estándar, y la distribución de datos de longitud centríolo de tipo salvaje, aly y puede . Número de la muestra para cada punto de datos está en paréntesis. Barra Escala, 1 m.

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Imaging Centrosomes in Fly Testes

Obtención de imágenes de las proteínas de Drosophila centrosomales durante la espermatogénesis es un método poderoso para identificar nuevas proteínas críticas para la biología del centrosoma, así como para dilucidar la función particular de los jugadores conocidos en este proceso.

Los centrosomas de imagen en Fly Testículos

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

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Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Implantación de Ferumoxides Etiquetada células madre mesenquimales humanas en los defectos del cartílago

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Investigación

Biología

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...