Целью этого протокола является визуализация агрегатов гетерохроматина в клетках дрозофилы. Для этого мы используем политеновые клетки, которые находятся в слюнных железах личинок третьей звезды Геном этих клеток амплифицируется почти в тысячу раз, а хромосомы сохраняют особенности интерфейсных клеток. Они имеют четко определенные теломеры и мосты, называемые хромоцентрами, в которых все центромеры агрегируются, и это в основном гетерохроматически.
Использование ткани личинок третьей звезды также позволяет оценить изменение гетерохроматических агрегатов в различных генетических мутантах. Чтобы оптимизировать культуру личинок третьей звезды, вам нужно будет сначала собрать взрослых особей в возрасте от 5 до 10 дней и поместить около 50 в бутылку с широким горлышком стандартного носителя. 25 мужчин и 25 женщин.
Поместите бутылку в инкубатор с контролируемой температурой при 25 градусах Цельсия в течение 12 часов. После того, как время инкубации закончится, удалите взрослых и перенесите их в новый флакон, чтобы повторить процедуру. Дайте эмбрионам вырасти при 18 градусах Цельсия в течение 22 часов.
Для сбора личинок убедитесь, что вы выбрали блуждающих личинок, которые не имеют явных сферических. Рассекните 15 пар слюнных желез или столько, сколько сможете за 30 минут периода в холодном PBS с ингибиторами протеста под микроскопом. Перенесите слюнные железы в другую трубку с ледяным холодом PBS.
Мойте один раз с холодным PBS плюс ингибиторы протестов. Помните, всегда ждите, пока ткань достигнет дна трубки. После удаления PBS с последней ступени добавьте непосредственно 0,5 миллилитра одного буфера фиксации смолы X-группы и 50% метанола плюс 2% формальдегида.
Инкубировать в течение двух часов при четырех градусах Цельсия с мягким вращением. Провести одну пятиминутную ротационную промывку с буфером Трис-Тритона, добавив один миллилитр. Всегда ждите, пока ткань достигнет дна трубки.
Примечание: подождите, пока ткань достигнет дна трубки. Инкубировать слюнные железы Трис-Тритоном, таким же, как и выше, плюс 1% бета-меркаптоэтанола в течение двух часов при 37 градусах Цельсия с легким встряхиванием. Промыть буфером BO3 и инкубировать с BO3 плюс 10 миллимолярным DTT при 37 градусах Цельсия с легким встряхиванием в течение 15 минут.
В конце инкубационного периода выполните промывку одним миллилитром только буфера BO3. Инкубируют слюнные железы в одном миллилитрах буфера В в течение двух часов при комнатной температуре с ротацией. Удалите весь буфер B и добавьте буфер A плюс интересующих антитела.
В этом случае мы используем HP one, A C 1 8 9 от банка Iridium. 1 к 3 000 за ночь при четырех градусах с вращением. В этот момент важно, чтобы встряхивание не поднимало пузырьки, которые могут повредить антитело.
Дать лакомство через 15 минут промыть буфером В, при перемешивании при комнатной температуре используя по одному миллиметру каждый раз. Железы переносятся в буфер В вместе со вторичной парой антибиотиков на пол в течение двух часов, при вращении на четыре градуса. На этом этапе важно покрыть трубку алюминиевой бумажной фольгой, чтобы защитить вторичное антитело от света.
Проводят 2х15 минутные шайбы при комнатной температуре, при этом вращение с помощью одного миллилитра буфера B.Инкубируют с ДНК-маркером, таким как Sydox или OH, и растворяют в одном миллилитрах буфера B в течение 10 минут при комнатной температуре с вращением. Провести одну стирку с буфером B и один раз с PBS, каждая стирка длится 10 минут, при этом вращаясь при комнатной температуре. Наконец, установите слюнные железы на горку, сделав бассейн с крышкой.
Поместите слюнные железы в середину бассейна и накройте Сидифлором. Чтобы избежать деформации пузырька, распространяйте вязкую жидкость по всему месту. Затем запечатайте все слайды прозрачным лаком для ногтей.
Наблюдают под флуоресцентным или конфокальным микроскопом. Если образец не будет наблюдаться в тот же день, то храните от света при четырех градусах. Репрезентативные результаты моноокрашения HB1 в слюнных железах Drosophila показаны на рисунке один.
Положительным результатом является наблюдение одной фокусной точки, как в А, атерохроматическом агрегате или конденсате. Отрицательным результатом является отсутствие сигнала или рассеянный сигнал. Иногда двойной сигнал может наблюдаться как двойная точка в С, но обычно встречается в меньших количествах.
Для анализа данных их можно представить в виде гистограммы, сравнивающей распределение HP1 с различными мутантными фонами. Например, на рисунке втором мы видим, что 98% ядер представляют собой распределение одной точки. И 2% из двух очагов дикого типа.
У мутанта пропорция изменилась, и наличие двух очагов увеличилось до 40%Рисунок третий показывает репрезентативное триметилирование лизина 9H3 в моноокрашении. Результат в drosophila слюнных желез наблюдается в одной фокусной точке в B, это благоприятный результат на хроматическом агрегате или конденсате, двойной или тройной сигнал в C можно увидеть в редких случаях, но в небольших количествах. В конце этого протокола вы сможете увидеть диахроматические конденсаты белка HP1, несмотря на ограничения состояния, это будет хороший первый подход.
