O uso de células válvulas isoladas de camundongos é essencial para investigar a via de sinalização que leva à calcificação da válvula no uso de células geneticamente modificadas de camundongos transgênicos. A digestão em duas etapas é um método rápido e eficiente. A parte mais desafiadora deste protocolo é o isolamento da válvula aórtica de oito semanas de ratos.
É melhor praticar em ratos mais velhos para visualizar melhor a válvula aórtica. Antes de iniciar o experimento, limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e espaço de trabalho com 70% de etanol e autoclave os instrumentos cirúrgicos por 30 minutos. Quando a configuração inicial estiver pronta, comece com a limpeza do peito e da região do abdômen de um rato eutanizado de oito semanas usando etanol.
Usando uma tesoura, abra o abdômen e o peito do rato, depois corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo com uma pequena tesoura cirúrgica. Remova o sangue do coração perfundiando 10 mililitros de PBS frio e corte o coração, mantendo três milímetros da aorta ascendente. Sob um estereótipo, disseca a válvula aórtica cortando o coração horizontalmente no meio dos ventrículos e cortando o ventrículo esquerdo em direção à aorta, em seguida, dissecar cuidadosamente a válvula aórtica.
Misture as válvulas em um pequeno prato de cultura de tecido de 35 milímetros. Lave as válvulas isoladas em um prato de cultura de células de 75 mililitros com cinco mililitros de HEPES frios recém-preparados de 10 mililitros complementados com antibióticos e incubar em cinco mililitros de colagenase tipo um por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação contínua. Após a incubação, centrifugar o tubo por cinco minutos, a 150 vezes G e lavar a pelota uma vez com dois mililitros de 10 mililitros HEPES com vórtice em alta velocidade por 30 segundos.
Colete a suspensão resultante do tubo em um prato de cultura de 35 milímetros e use pinças finas para transferir cuidadosamente os fragmentos de tecido para um tubo fresco. Em seguida, incubar a pelota em um tubo de 15 mililitros com cinco mililitros de colagenase tipo um a 37 graus Celsius sob agitação contínua por 35 minutos. Separe as células reutilizando com uma pipeta de um mililitro e centrífuga a 150 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Limpe as células duas vezes, reutilizando a pelota separada em dois mililitros de DMEM completos e centrifugando a 150 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Para chapeamento, resuspengue a pelota em um mililitro de meio completo e adicione-a a um poço de um prato de cultura de seis poços em uma quantidade mínima de meio. Mantenha as placas intactas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Após três dias de incubação, confirme o crescimento próximo aos detritos teciduais observando as células sob o microscópio. Uma vez que 1.000 células são visíveis, remova cuidadosamente os detritos teciduais com pinças autoclavadas e mude o meio. Trypsinize as células depois de atingir 70% de confluência e transfira-as para um prato de cultura de tecido de 75 mililitros.
Antes de iniciar o ensaio, limpe o capô de biossegurança com 70% de etanol e aqueça o MMEM médio a 37 graus Celsius. Em seguida, sementes 100.000 células por condição em seis placas de poço em DMEM completo e cultura a 37 graus Celsius. Após 24 horas, substitua o meio supernante pelo meio calcificador e incuba as células por sete dias a 37 graus Celsius, substituindo o meio no terceiro dia.
Após sete dias, meça a concentração de cálcio em uma placa de 96 poços usando o reagente Arsenazo III e registrando a absorvância em 650 nanômetros. Na análise representativa, vários fenótipos de células válvulas foram identificados com coloração imunofluorescente após três a cinco dias de cultura. Mouse VIC expressou vimentina e Alpha SMA, os marcadores significativos das células válvulas.
Além disso, a coloração imunofluorescente CD31 não verificou contaminação de células endoteliais na cultura VIC. Vic's de culturing com meio calcificador rico em fosfato estimulam uma calcificação nas células, ainda confirmada com a coloração positiva vermelha para nódulos de cálcio. O protocolo é baseado em um pool de três a cinco válvulas de diferentes ratos.
O uso de erva-ninhada e três diferentes réplicas biológicas é importante para validar os achados. O uso de células válvulas de camundongos é vital para entender o caminho molecular que leva à estenose aórtica isolando células de camundongos transgênicos. Este protocolo tem sido usado anteriormente para investigar a implicação do caminho para o receptor na regressão mineral da válvula aórtica calcificada.
