Die Verwendung isolierter Mausklappenzellen ist unerlässlich, um den Signalweg zu untersuchen, der zu einer Klappenverkalkung bei der Verwendung genetisch veränderter Zellen von transgenen Mäusen führt. Die zweistufige Verdauung ist eine schnelle und effiziente Methode. Der schwierigste Teil dieses Protokolls ist die Isolierung der Aortenklappe von achtwöchigen Mäusen.
Es ist besser, an älteren Mäusen zu üben, um die Aortenklappe besser zu visualisieren. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen und sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente für 30 Minuten. Wenn die ersteinrichtung fertig ist, beginnen Sie mit der Reinigung der Brust und der Bauchregion einer acht Wochen alten eingeschläferten Maus mit Ethanol.
Öffnen Sie mit einer Schere den Bauch und die Brust der Maus und schneiden Sie dann mit einer kleinen chirurgischen Schere zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel. Entfernen Sie Blut aus dem Herzen, indem Sie 10 Milliliter kaltes PBS durchtreiben und das Herz schneiden, wobei Sie drei Millimeter der aufsteigenden Aorta halten. Unter einem Stereomikroskop die Aortenklappe sezieren, indem Sie das Herz horizontal in der Mitte der Ventrikel schneiden und den linken Ventrikel in Richtung Aorta schneiden, dann sezieren Sie vorsichtig die Aortenklappe.
Die Ventile werden in einer kleinen 35-Millimeter-Gewebekulturschale zusammengepoolt. Waschen Sie die isolierten Ventile in einer 75 Milliliter Zellkulturschale mit fünf Millilitern frisch zubereitetem 10 Millimolar kaltem HEPES, ergänzt mit Antibiotika, und inkubieren Sie in fünf Millilitern Kollagenase Typ eins für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 150 mal G und waschen das Pellet einmal mit zwei Millilitern 10 Millimolar HEPES mit Wirbeln bei hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden.
Sammeln Sie die resultierende Suspension aus dem Röhrchen in eine 35-Millimeter-Kulturschale und verwenden Sie eine dünne Pinzette, um die Gewebefragmente vorsichtig in ein frisches Röhrchen zu überführen. Anschließend wird das Pellet in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Kollagenase Typ eins bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Bewegung für 35 Minuten inkubiert. Trennen Sie die Zellen, indem Sie sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette und einer Zentrifuge bei 150 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius erneut ausbelasten.
Reinigen Sie die Zellen zweimal, indem Sie das getrennte Pellet in zwei Millilitern vollständigem DMEM erneut auffüllen und bei 150 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Zum Plattieren das Pellet in einem Milliliter des vollständigen Mediums wieder aufsuchen und in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Zellkulturschale in einer minimalen Menge Medium hinzufügen. Halten Sie die Platten ungestört bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Bestätigen Sie nach drei Tagen Inkubation das Wachstum in der Nähe der Gewebetrümmer, indem Sie die Zellen unter dem Mikroskop beobachten. Sobald 1.000 Zellen sichtbar sind, entfernen Sie vorsichtig die Gewebeablagerungen mit einer autoklavierten Pinzette und wechseln Sie das Medium. Trypsinisieren Sie die Zellen nach Erreichen einer 70% Konfluenz und übertragen Sie sie in eine 75 Milliliter Gewebekulturschale.
Bevor Sie mit dem Assay beginnen, reinigen Sie die Biosicherheitshaube mit 70% Ethanol und erwärmen Sie das DMEM-Medium auf 37 Grad Celsius. Als nächstes säen Sie 100.000 Zellen pro Bedingung in sechs Bohrplatten in vollständigem DMEM und Kultur bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das überstandende Medium durch das kalzifizierende Medium und inkubieren Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius, wobei das Medium am dritten Tag ersetzt wird.
Messen Sie nach sieben Tagen die Kalziumkonzentration in einer 96-Well-Platte, indem Sie das Arsenazo III-Reagenz verwenden und die Absorption bei 650 Nanometern aufzeichnen. In der repräsentativen Analyse wurden verschiedene Klappenzellphänotypen mit immunfluoreszierender Färbung nach drei bis fünf Tagen Kultur identifiziert. Maus-VIMentin und Alpha-SMA, die signifikanten Marker von Klappenzellen, exprimieren.
Darüber hinaus bestätigte die immunfluoreszierende CD31-Färbung keine Kontamination durch Endothelzellen in VIC-Kultur. Die Kultivierung von VIC's mit phosphatreichem verkalkendem Medium stimuliert eine Verkalkung in den Zellen, was durch die rote positive Färbung für Kalziumknoten weiter bestätigt wird. Das Protokoll basiert auf einem Pool von drei bis fünf Ventilen von verschiedenen Mäusen.
Die Verwendung von Streupartnern und drei verschiedenen biologischen Replikaten ist wichtig, um die Ergebnisse zu validieren. Die Verwendung von Mausklappenzellen ist wichtig, um den molekularen Weg zu verstehen, der zur Aortenstenose führt, indem Zellen von transgenen Mäusen isoliert werden. Dieses Protokoll wurde bereits verwendet, um die Implikation des Signalwegs zum Rezeptor bei der mineralischen Regression der verkalkten Aortenklappe zu untersuchen.
