분리된 마우스 판막 세포의 사용은 형질전환 마우스에서 유전자 변형 된 세포의 사용에 밸브 석회화로 이어지는 신호 경로를 조사하는 데 필수적이다. 2단계 소화는 빠르고 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 8 주 마우스에서 대동맥 판막의 격리입니다.
대동맥 판막을 더 잘 시각화하기 위해 오래된 마우스를 연습하는 것이 좋습니다. 실험을 시작하기 전에 모든 수술 기구와 작업 공간을 70 %의 에탄올로 청소하고 살균하고 수술 기구를 30 분 동안 자동 복제하십시오. 초기 설정이 준비되면 에탄올을 사용하여 8 주 된 안락사 마우스의 가슴과 복부 부위를 청소하는 것으로 시작합니다.
가위를 사용하여 복부와 마우스 가슴을 열고 왼쪽 아트리움과 왼쪽 심실 사이를 작은 수술 가위로 잘라냅니다. 차가운 PBS의 10 밀리리터를 퍼포워심장에서 혈액을 제거하고 심장을 잘라 서 기른 대어타3밀리미터를 유지합니다. 스테레오현미경으로 심실 중간에 심장을 수평으로 절단하고 좌심실을 대동맥쪽으로 절단한 다음 대동맥 판막을 조심스럽게 해부합니다.
작은 35밀리미터 조직 배양 접시에 함께 밸브를 풀링합니다. 75 밀리리터 세포 배양 접시에 분리된 밸브를 세척하여 항생제로 보충된 10밀리머 콜드 헤페스 5밀리리터를 넣고 37도에서 30분 동안 콜라게나아제 타입 의 5밀리리터를 배양합니다. 인큐베이션 후, 튜브를 150배 G로 5분간 원심분리하고 10밀리미터 HEPES 2밀리리터로 30초 동안 고속으로 겔화하여 펠릿을 한 번 씻습니다.
35밀리미터 배양 접시에 튜브에서 결과 현탁액을 수집하고 조심스럽게 신선한 튜브로 조직 조각을 전송하는 얇은 핀셋을 사용합니다. 그런 다음 15 밀리리터 튜브에 펠릿을 배양하고 35 분 동안 지속적인 동요하에서 섭씨 37도에서 콜라게나아제 타입 1 5 밀리리터를 사용합니다. 섭씨 4도에서 5분간 1밀리리터 파이펫과 원심분리기를 150회 G로 재연하여 세포를 분리합니다.
완전한 DMEM의 2밀리리터에서 분리된 펠릿을 다시 중단하고 섭씨 4도에서 5분 동안 150회 G에서 원심분리하여 세포를 두 번 청소하십시오. 도금의 경우, 완전한 매체의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단하고 최소 한량의 배지로 6개의 잘 된 세포 배양 접시 중 하나에 첨가하십시오. 이산화탄소5%를 37도에서 방해받지 않도록 플레이트를 보관하십시오.
3일간의 잠복 후, 현미경의 밑에 세포를 관찰하여 조직 파편에 가까운 성장을 확인합니다. 일단 1, 000 세포가 보이는, 신중하게 자동 적인 핀셋으로 조직 파편을 제거하고 매체를 변경합니다. 70%의 합류에 도달한 후 세포를 트립시닉하고 75 밀리리터 조직 배양 접시로 옮기습니다.
분석을 시작하기 전에 생체 안전 후드를 70%에탄올로 청소하고 DMEM 중간을 섭씨 37도로 데우도록 데워주세요. 다음으로, 조건당 100, 000세포를 완전한 DMEM및 37도의 배양으로 6개의 우물 판으로 넣습니다. 24시간 후, 상체 배지를 석회화 매체로 교체하고 7일간 세포를 섭씨 37도에서 배양하여 3일째배지를 교체한다.
7일 후, 아르세나조 III 시약을 사용하고 650나노미터에서 흡광도를 기록하여 96웰 플레이트에서 칼슘 농도를 측정한다. 대표적인 분석에서, 다양한 판막 세포 표현형은 3~5일 의 배양 후 면역형 염색으로 확인되었다. 마우스 VIC의 발현 바이멘틴 과 알파 SMA, 밸브 세포의 중요한 마커.
추가적으로, CD31 면역형광 염색은 VIC 배양에 있는 내피 세포에서 오염이 확인되지 않았습니다. 인산염이 풍부한 석회화 매체를 가진 VIC를 배양하면 세포의 석회화를 자극하며 칼슘 노드에 대한 적색 양성 얼룩으로 더욱 확인됩니다. 프로토콜은 다른 마우스에서 3 ~ 5 밸브의 풀을 기반으로합니다.
쓰레기 메이트와 세 가지 다른 생물학적 복제의 사용은 연구 결과를 검증하는 것이 중요합니다. 마우스 판막 세포의 사용은 형질전환 마우스에서 세포를 격리하여 대동맥 협착증으로 이어지는 분자 경로를 이해하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 석회화 대동맥 판막의 미네랄 회귀에서 수용체에 통로의 의미를 조사하기 위해 이전에 사용되었습니다.
