Использование изолированных клеток мышиного клапана имеет важное значение для исследования сигнального пути, ведущего к кальцификации клапана при использовании генетически модифицированных клеток трансгенных мышей. Двухэтапное пищеварение является быстрым и эффективным методом. Наиболее сложной частью этого протокола является изоляция аортального клапана от восьминедельных мышей.
Лучше попрактиковаться на старых мышах, чтобы лучше визуализировать аортальный клапан. Перед началом эксперимента очистите и стерилизуйте все хирургические инструменты и рабочее пространство 70% этанолом и автоклавируйте хирургические инструменты в течение 30 минут. Когда первоначальная установка будет готова, начните с очистки груди и области живота восьминедельной усыпленной мыши с использованием этанола.
С помощью ножниц откройте живот и грудную клетку мыши, затем разрезайте между левым предсердием и левым желудочком небольшими хирургическими ножницами. Удалить кровь из сердца путем перфузии 10 миллилитров холодного PBS и разрезать сердце, сохранив три миллиметра восходящей аорты. Под стереомикроскопом рассеките аортальный клапан, разрезав сердце горизонтально в середине желудочков и разрезав левый желудочек по направлению к аорте, затем тщательно рассеките аортальный клапан.
Объедините клапаны вместе в небольшую 35-миллиметровую чашку для культивирование тканей. Промыть изолированные клапаны в чашке для культивации клеток 75 миллилитров с пятью миллилитрами свежеприготовленного 10-миллимолярного холодного HEPES, дополненного антибиотиками, и инкубировать в пяти миллилитрах коллагеназы типа один в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия с непрерывным встряхиванием. После инкубации центрифугируют трубку в течение пяти минут, при 150 раз G и промыть гранулу один раз двумя миллилитрами 10 миллимолярных HEPES с вихрем на высокой скорости в течение 30 секунд.
Соберите полученную суспензию из трубки в 35-миллиметровую чашку для культивирования и используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно перенести фрагменты ткани в свежую трубку. Затем инкубируют гранулу в 15-миллилитровой трубке с пятью миллилитрами коллагеназы типа один при 37 градусах Цельсия при непрерывном перемешивании в течение 35 минут. Разделите ячейки путем повторного использования с помощью одной миллилитровой пипетки и центрифуги в 150 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Очистите ячейки дважды, повторно инсценировка отделенной гранулы в двух миллилитрах полного DMEM и центрифугирование при 150 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Для нанесения покрытия повторно суспендируют гранулу в одном миллилите полной среды и добавляют ее в одну лунку чашки для культивирования шести лунок в минимальном количестве среды. Держите пластины нетронутыми при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.
После трех дней инкубации подтвердите рост вблизи тканевого мусора, наблюдая за клетками под микроскопом. Как только будет видно 1000 клеток, аккуратно удалите остатки тканей автоклавным пинцетем и измените среду. Трипсинизируют клетки после достижения 70% слияния и переносят их в 75-миллилитрную чашку для культуры тканей.
Перед началом анализа очистите вытяжку биобезопасности 70% этанолом и нагрейте среду DMEM до 37 градусов по Цельсию. Затем посейте 100 000 клеток в каждое условие в шесть пластин скважины в полном DMEM и культивирует при 37 градусах Цельсия. Через 24 часа замените надпочивающую среду кальцифицирующим средством и инкубируйте клетки в течение семи дней при 37 градусах Цельсия, заменяя среду на третий день.
Через семь дней измерьте концентрацию кальция в 96-скважинной пластине с помощью реагента Arsenazo III и записав поглощение на 650 нанометров. В репрезентативном анализе различные фенотипы клеток клапана были идентифицированы с иммунофлуоресцентным окрашиванием после трех-пяти дней культивирования. Мышиные ВИК экспрессировали виментин и альфа-SMA, значимые маркеры клеток клапана.
Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание CD31 подтвердило отсутствие загрязнения эндотелиальными клетками в культуре ВМЦ. Культивирование ВИЦ с богатой фосфатами кальцифицирующей средой стимулирует кальцификацию в клетках, что дополнительно подтверждается красным положительным окрашиванием для кальциевых узлов. Протокол основан на пуле от трех до пяти клапанов от разных мышей.
Использование помета и трех различных биологических реплик важно для подтверждения результатов. Использование клеток мышиного клапана жизненно важно для понимания молекулярного пути, ведущего к стенозу аорты, путем выделения клеток от трансгенных мышей. Этот протокол использовался ранее для исследования значения пути к рецептору в минеральной регрессии кальцинированного аортального клапана.
