간은 포유류에서 가장 큰 기관입니다. 그것은 신진 대사와 해독에 매우 중요 한 역할을. 간은 시험관내에서 놀라운 재생 능력을 가지고 있지만, 그것은 여전히 생체 외에서 문화 간세포에 장기적으로 매우 큰 도전이다.
여기서, 우리는 성숙한 간세포에서 간세포 오르간구를 설치합니다. 그것은 형태와 기능에 간세포의 주요 기능을 유지합니다. 이 비디오에서는 이러한 오르가노이드를 문화하고 통과하는 방법과 이러한 오르가노이드의 유전자 변형을 자세히 소개합니다.
첫째, 간 관류와 소화. 모든 지역과 악기를 준비하고 멸균합니다. 마우스를 씻고 표피와 피부를 열고 간 파우치 오븐을 찾으려고 노력합니다.
바늘을 주입한 다음 이를 캡처합니다. 간이 창백해질 때까지 분당 5 밀리리터의 속도로 관류를 수행하십시오. 관류 완충액으로 바꾸고, 조심스럽게 놓고, 간을 보고 부드러워질 때까지.
보통 3~5분 정도 걸린 다음 간을 자르고 접시에 넣고 가위로 작은 조각으로 자릅니다. 자주 위아래로 펩. 일반적으로 단일 셀로 만드는 데 10~15분이 걸립니다.
그리고 10-15분 으로 위아래로 조절하고 피터를 통해 먹이를 주면 됩니다. 단일 셀로 만듭니다. 50 밀리리터 튜브의 모든 세포를 수집하고, 경심분리, 속도와 함께 다음 플레이트 당 모든 수집.
차가운 얼음에 항상 그들을 유지하려고합니다. 단일 셀 현탁액을 만들고 셀 카운터로 계산합니다. 일반적으로 행복 하면 간 세포, 그것은 활기찬 형광.
두 번째 부분, 우리는 세포를 앉아서 오르가노이드 문화를하려고합니다. 우리는 모든 세포 현탁액을 수집하고 특정 concentro-fusion으로 세포를 계산한 다음 혼합합니다. 메트로겔스. 및 코드 매체.
보통 우리는 매체와 메트로겔을 1 대 2 또는 1 또는 3의 비율로 취합니다. 조심스럽게 혼합 한 후, 우리는 그라데이션 플레이트에 앉아. 우리는 일반적으로 잘 24 접시에 100 마이크로 리터를 추가합니다.
37도의 온도에서 인큐베이터에 넣어. 20분 후, 우리는 바닥으로 앞뒤로 놓은 다음 매체에서 진행합니다. 2~3일 동안 대응하면 보통 오르가노이드가 나오는 것을 볼 수 있습니다.
이것은 우리의 오르가노이드의 전형적인 이미지입니다. 우리는 일반적으로 우리가 통로를 하거나 몇몇 유전 수정 방법을 하고 싶은 경우에 오르가노이드에서 단 하나 세포가 필요합니다 우리는 코트 세척 버퍼를 가진 카운터 플레이트에서 모든 오르가노이드를 수집합니다. 우리는 상체를 떨어 뜨린 다음 코트 워시 버퍼를 접시에 넣고 섞어 위아래로 섞습니다.
그리고 우리는 일반적으로 워시 테이프 버퍼로 모든 팁을 미리 씻습니다. 모든 오르가노이드팁을 피하기 위해 팁에 팁을 줍니다. 그리고 얼음에 새로운 배치또는 얼음없이, 우리는 센트로 융합에 의해 모든 오르가노이드를 수집합니다.
우리는 그들을 치료, 모든 메트로겔을 제거하는 속이는 radients이있다. 얼음에 잠복20~30분 후에 모든 메트로겔이 제거됩니다. 우리는 모든 깨끗한 오르가노이드를 수집하고 트립신을 추가하여 단일 세포로 만듭니다.
트립신이 추가된 후, 우리는 인큐베이터로 오르가노이드를 치료합니다. 간 오르가노이드가 단일 세포가 되는 데는 5~10분이 걸립니다. 우리는 삼중을 중지하기 위해 더 많은 세척 버퍼를 추가합니다.
그리고 그들을 향해 위아래로 그것을 pep. 옵션 프로세스의 경우 모든 트립신을 제거하기 위해 한 번 더 씻을 수 있습니다. 중혈으로 씻은 후, 우리는 세포 카운터에서 계산할 수 있습니다.
그런 다음 이러한 간세포 오르간노이드의 거래 또는 트랜스페션을 수행하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 당신이 할 일의 튜브에 라벨을 지정하고, 우리는 제조 업체의 지시에 따라 시력 트랜스펙트를 할 것입니다. 당신은 리포일 사실 길들이기 INI MaX의 섭정이 필요합니다.
우리는 추가합니다. 제조 업체의 지시에 따라 제어 및 특정 유전자 siRNA, 최적의 으로 그들을 배양. 그리고 세포 농도에 따라 우리는 RAN 최대를 추가하고 철저하게 혼합합니다.
그런 다음 최적의 RAN max를 별도로 추가하고 얼음위에 놓습니다. 5 분 후, 우리는 다른 siRNAs, 특정 유전자 RANi 및 II 제어와 별도의 RAN 최대 혼합물을 펩과 철저하게 혼합. 다시 얼음에 넣어, 우리는 모든 오르가노이드를 수집, 느린 중심 투과, 모든 슈퍼 나티컬을 드롭, 우리는 RNAi 최대를 추가, 이 세포 판에 siRNA 혼합물을 추가하고 철저하게 위아래로 펩.
간략하게, 세포 및 레이블 RNAi 최대 및 siRNA 혼합물은 37도에서 4 5 시간 동안 젠트리피케이션 및 인큐베이션하였다. 마지막 부분, 이 간세포 오르간노이드는 또한 렌티 바이러스에 의해 감염될 수 있었습니다. 유사한 메시지는 siRNA 형질전환으로 수행되었다.
대조군과 siRNA 바이러스 튜브는 잘 준비되었고, 제조 업체의 지시에 따라 최적의 튜브가 추가되었습니다. 그런 다음 폴리 그린과 같은 감염 부위와 함께 제조업체의 지침 체에 따라 다른 Lenti 바이러스를 추가합니다. 1.5 밀리리터 eppendorf 튜브에서 오르가노이드 배양 및 다양한 입자에 단일 세포 현탁액을 결합하여 이 혼합물을 혼합하고 32도에서 1 시간 동안 농축합니다.
농축융합은 500G.에서 수행되며, 4~5시간 배양 후 37도에서 세포 현탁액을 수집하고 메트로겔에 앉게 된다. 그리고 다시 인큐베이터에 넣어. 형성 효율 또는 기타 기능 분석에 대한 기관은 7~10일 후에 수행될 수 있다.
다음은 우리의 대표적인 결과입니다. 그림 1A에서, 당신은 마우스에서 우리의 ALB-Cre Rosa 26-GFP 또는 RFP 간세포 오르간로이드를 볼 수 있었습니다. 그림 1B에서 당신은 우리의 간세포 오르간이 확산되는 것을 보여 주었다 염색에 Ki67 긍정적 인 신호를 볼 수 있습니다.
그림 2A 및 2B에서 여기에서 우리의 유전자의 우리의 간섭발현의 대표적인 유전자 발현입니다. 간세포 에서 유전 조작 후 오르가노이드, 간섭 효과적인 매우 효율적입니다. 여기에 그림 2C입니다, 당신은 우리의 뮤린 오르가노이드에서 카슨 기술로 유전자 조작 후 볼 수 있습니다.
결론, 우리의 결과는 간세포 오르가노이드가 시험관내에서 확장되고 유전적으로 조작될 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 요약하자면, 이 비디오에서는 간 관류와 소화를 통해 간 세포에 대한 방법을 보여줍니다. 간세포를 포착하고 간세포 가구를 통과하는 방법.
또한, 우리는 이러한 오르가노이드의 유전적 수정을 하기 위해 siRNA 및 벡터 형질 또는 렌티 바이러스 감염을 수행하는 방법을 보여 주었다. 또한, 우리는 우리의 오르가노이드에 두 가지 부족이있다. 첫째, 우리는 간세포를 순수하게 하기 위해 코어 또는 모피 코어당 사용하지 않았습니다.
둘째, 더 많은 성장 인자와 시그널링이 성장하는 오르가노이드를 개선하기 위해 노력해야 한다고 생각합니다.
