Este protocolo expone a las células cancerosas en suspensión a breves pulsos de estrés por cizalla de líquidos para imitar ciertos aspectos de cómo las células cancerosas metastásicas están expuestas a las fuerzas hemodinámicas mientras están en el sistema circulatorio. Es una técnica relativamente simple para aplicar pulsos breves de estrés de cizalla de fluidos de alto nivel. Al intentar este protocolo, tenga cuidado con las agujas sin tapa y no las doble, ya que esto cambiará la tensión de cizallamiento de la fuerza aplicada.
Este procedimiento puede producir aerosoles, así que use las medidas de seguridad apropiadas. Para comenzar, libere de 70 a 90% de células PC3 confluentes de la placa de cultivo de tejidos aspirando el medio de crecimiento y lavando la placa de 10 centímetros con cinco mililitros de PBS libre de calcio y magnesio. Luego, aspire el PBS y agregue un mililitro de tripsina al 0.25%.
Después de la tripsinización, observe el desprendimiento de las células bajo un microscopio invertido. Para inhibir la tripsina, agregue cinco mililitros de medio DMEM/F12 que contenga 10% FBS. A continuación, coloque la suspensión celular en un tubo cónico y determine la concentración celular y el número total de células.
Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante tres minutos, luego aspirar el sobrenadante y volver a colocar el pellet en un medio de cultivo de tejido libre de suero. Corte alrededor de la parte inferior del tubo de poliestireno de 14 mililitros en la línea de siete mililitros y coloque la suspensión de celda mixta en el tubo de corte. Recolecte por separado muestras de control estático de células antes de la exposición al estrés por cizallado de líquidos para usarlas para realizar ensayos.
Para exponer la muestra de suspensión celular restante a la tensión de cizallamiento del fluido, extraiga la suspensión celular en una jeringa de cinco mililitros y conecte una aguja de media pulgada calibre 30. Coloque y asegure la jeringa con una aguja sin tapa en una bomba de jeringa y establezca el caudal para lograr el nivel deseado de tensión de cizallamiento del fluido. Haga funcionar la bomba de la jeringa y recoja la muestra cortada en el tubo de corte en un ángulo de aproximadamente 45 grados para reducir la formación de espuma.
Retire cuidadosamente la jeringa de la bomba de la jeringa y use alicates para quitar la aguja, teniendo cuidado de no tocarla. Repita el procedimiento hasta que la suspensión celular haya sido expuesta al número deseado de pulsos de tensión de cizallado de fluido. Realice ensayos de viabilidad con las muestras estáticas antes de exponer las células a la tensión de cizallamiento del fluido.
Para ensayos enzimáticos, transfiera 100 alícuotas de microlitros de las muestras estáticas por duplicado a una placa de 96 pozos. Luego, recolecte 100 microlitros de muestras después de la exposición al estrés por cizallamiento de fluidos y colóquelos en una placa de 96 pozos. Agregue 20 microlitros de una solución de resaurina de 0,15 miligramos por mililitro a cada pozo de muestra y a los pomos que contengan 100 microlitros de medio solo.
Incube las placas del pozo en la incubadora de cultivo de tejidos de 37 grados Celsius durante dos horas, luego mida la fluorescencia y la absorbancia utilizando un lector de placas y obtenga el porcentaje de células viables comparando la señal promedio de cada una de las muestras expuestas al estrés por cizallamiento del fluido con la muestra de control promedio a estática. Del mismo modo, recolectar alícuotas de muestras estáticas para realizar citometría de flujo y ensayos clonogénicos como se describe en el manuscrito de texto. En el análisis representativo, la viabilidad de la biopsia singénica de células cancerosas epiteliales mamarias se evaluó mediante la conversión de resazourina después de exponer las células a una serie de pulsos de estrés por cizallamiento de líquidos.
A pesar de que cada línea celular mostró diferentes perfiles de resistencia, no hubo diferencias significativas en la viabilidad después de 10 pulsos de exposición al estrés por cizallado de fluidos. Líneas celulares de cáncer adicionales de una variedad de orígenes tisulares demostraron la viabilidad de más del 20% después de 10 pulsos de estrés por cizallaje de fluidos, a excepción de las células MIA PaCa-2, que mostraron una viabilidad de menos del 10% debido a la sensibilidad a la destrucción mecánica por estrés por cizallaje de fluidos. Al recolectar la muestra estática antes de aplicar la tensión de cizallamiento de fluidos, asegúrese de que la suspensión celular sea una mezcla homogénea.
Retire cuidadosamente la aguja con alicates y no doble ni toque la aguja. Además de medir la viabilidad celular, se pueden evaluar los cambios en la expresión génica, la señalización celular, la proliferación y la migración. Usando esto como un modelo de exposición al estrés por cizallamiento de fluidos, se puede estudiar cómo las células cancerosas resisten la destrucción por estrés por cizallamiento de fluidos y evaluar los efectos del estrés por cizallamiento de fluidos en la biología de las células cancerosas.
Esta técnica ha sido utilizada por nuestro laboratorio y otros para explorar los efectos del estrés por cizallamiento de líquidos en las células tumorales circulantes. Estos estudios han demostrado que el estrés por cizallamiento de fluidos altera rápidamente las propiedades mecánicas de las células cancerosas y que esto contribuye a la capacidad de las células cancerosas para resistir la destrucción por estrés por cizallamiento de fluidos.
