Este protocolo proporciona un método simple, rápido y reproducible para inducir una lesión cerebral traumática por fuerza contundente escalable en peces cebra adultos. Los peces cebra adultos que sufren esta lesión cerebral traumática de fuerza contundente exhiben muchas de las características observadas en humanos que sufren de una lesión cerebral traumática de fuerza contundente. Demostrando el procedimiento estarán el Sr. James Hentig y la Sra. Kaylee Cloghessy, dos estudiantes de doctorado de mi laboratorio.
Comience llenando una placa de Petri con arcilla de modelado. Luego use los dedos o la parte posterior de un par de fórceps para crear una plataforma elevada con arcilla de modelado adicional. Divida la plataforma elevada longitudinalmente en dos mitades aproximadamente iguales con una cuchilla de afeitar.
Forma las dos mitades en un canal, de modo que se adapte a la longitud de un pez adulto. Use arcilla adicional para construir paredes para asegurar 2/3 del cuerpo del pez con la cabeza expuesta. Moldee un pequeño soporte en la región de la cabeza expuesta perpendicular a las paredes para evitar la rotación o el retroceso de la cabeza en caso de lesión.
Asegúrese de que los lados del canal no impidan la caída de peso. Use un mini taladro para crear un disco de acero de 3 milímetros a partir de un destello de acero de calibre 22. Coloque un pez anestesiado que no responda al pellizco de la cola en el molde de arcilla dentro del canal con su lado dorsal hacia arriba para que su cuerpo esté asegurado a los lados.
Coloque el disco de acero de calibre 3 milímetros y 22 en la cabeza, centrado sobre el punto de impacto deseado. Alinee el pez perpendicularmente para evitar que su cabeza se incline hacia un lado, lo que podría causar un impacto desigual. Use un soporte de anillo estándar y una abrazadera de brazo para asegurar el tubo de acero o plástico, asegurándose de que esté recto, de modo que la parte inferior del tubo esté a 1,5 centímetros por encima de la cabeza del pez cebra.
Mire hacia abajo el tubo para asegurarse de que esté alineado por encima de la placa de acero. Elija el rodamiento de bolas adecuado en función de la gravedad deseada de la lesión. Deje caer el rodamiento de bolas desde una altura predeterminada por el tubo sobre la placa de acero.
Luego coloque los peces heridos en el tanque de recuperación para ser monitoreados. Llene una placa de Petri con arcilla de modelado y cree una pequeña cavidad para apoyar el cuerpo durante la disección. Coloque el pescado en el molde de arcilla con el lado dorsal hacia arriba.
Coloque dos pasadores de disección, uno a través de la línea media hasta la mitad del cuerpo y el otro alrededor de 5 milímetros detrás de la base de la cabeza. Use un par de fórceps Dumont para cortar sin rodeos el nervio óptico y extirpar los ojos. Coloque un extremo de las 5 pinzas debajo de la placa parietal derecha.
Haga una acción deliberada de tijera moviéndose hacia el extremo rostral y retire la placa frontal derecha. Luego gire el pez 90 grados en el sentido de las agujas del reloj. Coloque un extremo de las 5 pinzas debajo de la placa parietal izquierda y use el mismo movimiento de tijera para eliminar las placas parietal y frontal izquierda, exponiendo todo el aspecto dorsal del cerebro.
Use las 5 pinzas para transectar sin rodeos el maxilar de modo que los bulbos olfativos se conserven y no se dañen. Usando los mismos fórceps, retire el opérculo derecho, el preopérculo, el interórculo y el subópercleo. Luego reseque sin rodeos la musculatura en el extremo caudal del calvario para exponer la médula espinal.
Usando los fórceps, transecte sin rodeos la médula espinal. Coloque los fórceps cuidadosamente debajo del cerebro y retire suavemente el cerebro del calvario. Diseccionar todo el cerebro o la región de interés utilizando las instrucciones del manuscrito de texto, y colocar el cerebro inmediatamente en un pequeño bote de pesaje con fórceps finos, teniendo cuidado de no apuñalar o raspar el cerebro.
Transfiera el cerebro al bote de pesaje de secado de alquitranes y registre el peso húmedo del cerebro. Oriente los cerebros para colocarlos planos en el bote de pesaje con el lado dorsal hacia arriba. Luego coloque el cerebro y el bote de pesaje de secado en un horno de hibridación a 60 grados centígrados durante ocho horas.
Para transferir el cerebro a un nuevo bote de pesaje pequeño alquitranado una vez que esté seco, pellizque las pinzas finas juntas y, comenzando en el lado ventral del cerebro, recoja en un movimiento ascendente. Haga una incisión parcial en una esponja húmeda. Coloque un pez a la vez en la abertura con el lado ventral hacia arriba y use una aguja de calibre 30 para inyectar aproximadamente 40 microlitros de EdU milimolar en el cuerpo del pez.
Luego devuelva los peces al tanque de retención lleno de agua del sistema. Recoja los cerebros como se mencionó anteriormente y colóquelos como un grupo en un vial de vidrio de 9 mililitros que contenga 2 mililitros de nueve partes 100% etanol a una parte 37% formaldehído. Fije los cerebros a 4 grados centígrados en una plataforma basculante.
Use un mandril de criostato para incrustar los cerebros en TFM en la orientación deseada sobre hielo seco. Se encontró que la lesión vascular es una de las patologías más fáciles y prominentes para identificar lesiones exitosas a través de este modelo. La capacidad de identificar el indicador cambió con la tensión de los peces utilizados durante la lesión.
La identificación de la lesión vascular en el tipo AB silvestre fue difícil de distinguir entre LCT leve o moderada y peces de control no dañados debido a la pigmentación. Después de la lesión, los peces TBI leves mostraron abrasiones superficiales mínimas, mientras que los peces TBI moderados exhibieron una hemorragia cerebral limitada. El alcance de la lesión fue evidente en peces con LCT grave.
Por el contrario, la lesión vascular se puede identificar fácilmente cuando se usa pescado albino o Casper. La hinchazón del cerebro debido a una lesión se evaluó mediante edema. En contraste, tanto la LCT moderada como la LCT grave tuvieron edema significativo, 1 dpi y 3 dpi, pero el contenido de líquido tanto de la LCT moderada como de la LCT grave volvió a niveles que se asemejaban a los controles no dañados en 5 dpi.
Esta lesión por fuerza contundente resultó en una respuesta robusta de proliferación celular que abarca el neuroeje. Se observó un aumento del marcado de EdU en las zonas ventricular y subventricular del cerebro anterior en comparación con los controles no dañados. Los cerebros lesionados mostraron un aumento en el etiquetado de EdU en la zona gris periventricular, los lóbulos tecttales ópticos y aspectos del hipotálamo anterior en comparación con el cerebro de pez no dañado.
Después de una LCT grave, las regiones neurogénicas en el cerebro posterior exhibieron una mayor proliferación celular en comparación con el cerebro no dañado. Para una inducción adecuada de la lesión, asegúrese de que los peces estén asegurados y estables en el molde, y que el tubo esté recto para evitar un impacto descentrado o alterar la trayectoria de caída de peso. Este procedimiento proporciona un método de inducción de lesión por fuerza contundente rápido y rentable aplicado a un modelo regenerativo que sería especialmente aplicable para traumatismos craneales repetidos o estudios regenerativos inducidos por lesiones.
