Nuestro cuerpo genera de uno a 10 mil millones de células apoptóticas cada día. El aclaramiento eficiente de estas células ayuda a eliminar los desechos celulares y mantener los inventarios. Este método se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la unión de células apoptóticas y la ingesta por muchos otros tipos de células fagocíticas.
Demostrar este procedimiento estará Yuxuan Zhen, un técnico superior en mi laboratorio. Para cosechar timocitos, después de abrir la cavidad torácica de un ingenuo ratón C57 negro 6, usa pinzas de punta fina curva para sacar el timo. Coloque el órgano en una placa de cultivo de tejido que contenga 10 mililitros de RPMI 1640 Medio.
Moler todo el timo contra los extremos esmerilados de dos diapositivas de microscopio y filtrar la suspensión de tejido resultante a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Recoger los timocitos por centrifugación y resuspender el pellet en 40 mililitros. Después de contar, centrifugar las células de nuevo y resuspend hasta dos veces 10 a las ocho células en 20 mililitros de PBS fresco por tubo de 50 mililitros.
Etiquete las células con cinco cfSE micromolares en 20 mililitros de PBS por tubo. Invierta los tubos de dos a tres veces para mezclar antes de incubar los timocitos durante no más de dos minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, detener la reacción con 10 mililitros de suero de caballo inactivado por calor y recoger las células por centrifugación.
Resuspender las células etiquetadas en 40 mililitros de PBS fresco para el conteo y centrifugación seguido de un lavado adicional con 40 mililitros de medio. Después del lavado medio, resuspender los timocitos a siete veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media de cultivo de tejido y sembrar las células en un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros. A continuación, añadir estaurosporina al cultivo celular en una concentración final de un micromolar y colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante cuatro horas.
Para el aislamiento de macrófagos peritoneales, inyecte dos ratones C57 negros 6 por vía intraperitoneal con un mililitro de tiolitismo envejecido en el día cero antes de abrir la piel abdominal sin alterar el peritoneo en el día cinco. Para lavar la cavidad peritoneal, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para empujar rápidamente 10 mililitros de tampón de lavado en la cavidad antes de aspirar lentamente el tampón de lavado para su recolección en un tubo de 50 mililitros. Lave el lavado peritoneal dos veces con PBS.
Resuspender los macrófagos peritoneales a dos veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media de cultivo tisular. Próxima semilla 500 microlitros de macrófagos en cada pozo de una placa de 24 pozos y colocar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante dos horas. Al final de la incubación, aspirar el sobrenadante para eliminar las células flotantes y añadir 500 microlitros de medio de cultivo tisular a cada pocótulo.
Añadir inmediatamente cero a 12 veces 10 a los seis timocitos en 500 microlitros de medio a cada pozo del cultivo y colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejido durante cuatro horas. Al final de la incubación, lavar cada pozo dos veces con PBS fresco para eliminar cualquier célula apoptótica flotante libre seguido de un solo lavado con tampón de tinción. A continuación, etiquete los macrófagos unidos a la placa con 200 microlitros de tampón de tinción complementados con un anticuerpo anti-CD11b apropiado por pozo y coloque la placa a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
En este experimento representativo, hasta el 30% de los macrófagos peritoneales estimulados por tioglycollato demostraron una señal positiva en el canal CFSE que indicaba que estos fagocitos habían ingerido células apoptóticas etiquetadas por CFSE. La observación microscópica del engufato de macrófagos de las células apoptóticas es esencial para investigar la capacidad de los macrófagos para ingerir células apoptóticas como macrófagos positivos de CFSE repartidos en el cuadrante inferior derecho debido a diferentes intensidades que indican que el número de células apoptóticas dentro de los macrófagos individuales es diferente. Una mayor proporción de células apoptóticas a macrófagos no sólo aumenta el número de macrófagos que ingieren células apoptóticas, sino que también mejora la capacidad de los macrófagos para ingerir más células apoptóticas.
En otro conjunto de experimentos, alrededor del 15% de los macrófagos se convirtieron en CFSE positivos cuando CFSE etiquetó timocitos apoptóticos se añadieron a la cultura de los macrófagos durante cuatro horas, lo que indica que estos macrófagos eran los macrófagos fagocíticos. El anticuerpo Mer bloquea la efferocitosis de macrófagos de una manera dependiente de la dosis y la obstrucción general puede representar alrededor del 30% de la eficiencia de la efferocitosis en el entorno actual. Además, un inhibidor del receptor TAM recientemente aprobado atenúa la efferocitosis de macrófagos de una manera dependiente de la dosis hasta una concentración de aproximadamente 100 nanomolares.
Recuerde siempre comprobar el porcentaje de células apoptóticas, ya que este número afecta directamente a la eficiencia de la efferocitosis. Los macrófagos fagocíticos pueden ser analizados más a fondo por Western blot para investigar las moléculas de señalización reguladas por el proceso de engullimiento y por microscopía para estudiar la dinámica del engullimiento.
