Usando este protocolo, los lisados celulares bacterianos de alta calidad se pueden producir utilizando solo equipos de laboratorio comunes ampliamente disponibles, lo que hace que la expresión génica libre de células sea fácilmente accesible para la mayoría de los investigadores. La combinación de la autólisis celular del programa con un ciclo de congelación-descongelación o liofilización permite crear un enfoque práctico, laboral y rentable para la producción rápida de lisados bacterianos para la expresión génica libre de células. Comience usando un asa de inoculación para rayar las células de una cepa de E. coli de autólisis en placas de agar LB que contienen 50 microgramos por mililitro de ampicilina, luego incube las placas a 37 grados Celsius durante la noche.
Al día siguiente, usando una punta de pipeta, recoja una sola colonia de la placa de agar y agréguela a un tubo de cultivo que contenga medio LB con ampicilina. Cultive este cultivo iniciador a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue 400 microlitros del cultivo iniciador en un matraz Erlenmeyer de un litro que contenga 400 mililitros de medio 2xYTPG complementado con 50 microgramos por mililitro de ampicilina.
Incubar el cultivo a 37 grados centígrados con agitación a 300 RPM. Utilizando un espectrofotómetro y una cubeta óptica con una longitud de trayectoria de un centímetro, mida periódicamente la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros. Cuando la densidad óptica exceda una, comience a diluir el cultivo cinco veces antes de las mediciones para asegurarse de que las mediciones permanezcan dentro del rango lineal de un espectrofotómetro de laboratorio típico.
Una vez que la densidad óptica del cultivo diluido quíntuple alcance 0.3, retire el matraz de la incubadora y proceda a preparar el lisado. Para preparar el lisado, cosecha las células por centrifugación a 1, 800 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Vierta el sobrenadante y retire el líquido restante con una pipeta.
Agregue 45 mililitros de tampón frío S30A al pellet y vuelva a suspender el pellet mediante vórtice. Luego, pese un tubo de centrífuga vacío de 50 mililitros antes de transferir las células al tubo. Centrifuga las células de nuevo y descarta el sobrenadante.
Aspire cualquier sobrenadante restante usando una pipeta. Pesar el tubo de nuevo y restar el peso del tubo vacío del peso mostrado para obtener el peso del pellet. Por cada miligramo de pellet celular, agregue dos microlitros de tampón frío S30A complementado con dos ditiotreitol milimolar.
Luego, resuspende las células mediante vórtice vigoroso. A continuación, congele las células colocándolas en un congelador negativo de 20 o 80 grados centígrados negativos hasta que el pellet esté completamente congelado, luego descongele las células en un baño de agua a temperatura ambiente y vórtice vigorosamente durante dos o tres minutos. Incubar las células a 37 grados Celsius durante 45 minutos con agitación a 300 RPM, luego limpiar la muestra de desechos celulares pesados centrifugando en tubos de centrífuga transparentes a 30, 000 x g durante 45 minutos a cuatro grados Celsius.
Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo con una pipeta, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Si el sobrenadante transferido está contaminado con material del pellet, repita la centrifugación. Transfiera el sobrenadante a tubos centrífugos de 1,5 mililitros.
Y centrifugar una vez más a 21, 000 x g o la velocidad máxima de una centrífuga de mesa durante cinco minutos. Aliquote el autolisado despejado en los volúmenes deseados y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para la expresión génica libre de células utilizando el autolizado, mezcle ocho microlitros de autolizado y 8,9 microlitros de premezclado en hielo.
Añadir ADN a una concentración final de ocho nanomoles, cualquier otro reactivo necesario y agua para obtener un volumen final de 20 microlitros. Agregue la reacción a una microplaca de 384 pocillos y use un lector de placas para medir el curso del tiempo de fluorescencia y los puntos finales. La expresión de GFP utilizando el autolizado con una serie de dilución de ADN plasmático da como resultado una expresión fuerte incluso con un ADN nanomolar.
Al comparar la expresión GFP entre un lisado disponible comercialmente y el autolizado, el autolisato produjo niveles comparables de GFP. La variabilidad entre los lotes de lisado producidos en dos laboratorios diferentes por diferentes investigadores fue de aproximadamente dos veces. Las tres variables más críticas son la relación de pellet celular a tampón, la transferencia de sobrenadante libre de escombros y el uso de una concentración óptima de PEG y magnesio en la reacción final.
Una vez que se ha preparado el extracto, se puede utilizar un gran arsenal de protocolos existentes desarrollados para los sistemas de expresión libre de células de E. coli, como la degradación mediada por ClpXP o la detección de quórum mediada por AHL.
