El trabajo que lleva a esta publicación ha recibido financiación del programa Marie Curie COFUND &quot;U-Mobility&quot;, cofinanciado por la Universidad de Málaga y el Programa de la Unión Europea el 7 º Programa Marco (FP7/2007-2013) bajo anestesia general N º 246550. El trabajo en nuestro laboratorio es apoyado por subvenciones del NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD y BSF a VC

1. La expresión de proteínas <ol><li> Elección del sistema de expresión Seleccione el sistema, es decir, los vectores y el método de entrega de vectores, el más adecuado para la expresión de la proteína de interés en el modelo de organismo / celda específica. Tenga en cuenta que nuestro ensayo requiere la expresión de las proteínas de la prueba en cantidades fácilmente detectables, lo que se consigue mejor mediante la transformación transitoria de un gran número de células. En las plantas, por ejemplo, esto se realiza mejor usando plásmidos binarios como vectores de expresión y de Agrobacterium como sistema de entrega. </li><li> Construcción de vectores de expresión binarios Clonar la secuencia codificante (s) de la proteína (s) de interés en un vector de expresión, ya sea solo o en fusión traduccional a una etiqueta de epítopo. Uso vectores adecuados para el sistema de expresión elegido y procedimientos estándar de biología molecular para la clonación de genes. Para la entrega de genes mediada por Agrobacterium, emplear vectores binarios y introducirlos, también utilizando Standaprotocolos Rd, en una cepa de Agrobacterium, tales como EHA105, para la posterior inoculación de tejidos de plantas. </li><li> Elección de las especies de plantas Seleccionar las especies de plantas en el que se expresa la proteína (s) de interés. Tenga en cuenta que, mientras que cualquiera de las especies de plantas susceptibles a la transformación genética mediada por Agrobacterium se pueden utilizar, nuestros especies de plantas de elección es Nicotiana benthamiana, que se cultiva fácilmente, altamente susceptibles a Agrobacterium, y tiene grandes hojas que se inoculan fácilmente. </li><li> Crecimiento de las plantas Haga crecer una planta de 4 a 6 semanas en una olla con Pro-Mix BX en una olla (20 cm x 20 cm x 20 cm) en condiciones de ambiente controlado-(por ejemplo, la cámara de crecimiento) de día largo (es decir, 16 h de 130 -150 E · m-2 s-1 la luz a 23 º C y 8 ​​h oscuridad a 20 ° C) y una humedad relativa del 40-65%. 1.5.2 Abono de vez en cuando con los productos disponibles en el mercado según las instrucciones del fabricante. Una vez que la planta se cultiva, seleccionehojas con el tamaño de 50 mm x 70 mm o mayor (estas mediciones de longitud no incluyen el pecíolo) para la inoculación de Agrobacterium. </li><li> La inoculación con Agrobacterium Crecer la cepa de Agrobacterium que alberga la construcción binaria que expresa la proteína (s) de prueba de la etapa 1.3 durante la noche a 28 ° C en medio YEP (1% de peptona, extracto de levadura 1%, y 0,5% de NaCl) suplementado con los antibióticos apropiados (por ejemplo, 100 mg / l de estreptomicina y 10 mg / L de rifampicina para los vectores basados ​​en pPZP-RSC2 24-25). 1.6.2 Centrifugar las células, se resuspendieron a OD 600 = 0,5 en tampón de infiltración [10 mM de MgCl 2, Mes 10 mM (pH 5,6), acetosiringona 100 mM], y se incuba durante 2 h a temperatura ambiente. Infíltrate en la cultura en la cara abaxial de una hoja, utilizando una jeringa sin aguja 1-ml; en cuenta que las hojas se inoculan in situ, mientras que está unido a la planta. 1.6.3 Después de la infiltración, cultivar la planta durante 72 h bajo el régimen de luz de 16 h 130-150 y# 181; E m-2 s-1 la luz a 23 ° C / 8 h oscuridad a 20 ° C antes de la cosecha. </li><li> La aplicación de inhibidores de proteasomal Para apoyar la idea de que la proteína (s) prueba es degradada por una vía proteasoma, usar inhibidores de proteasomal MG132 específicos y lactacistina 28-29, lo que debería reducir o incluso bloquear la degradación. Cuatro horas antes de la cosecha (ver Paso 2.1), infiltrarse en las áreas de la hoja inoculado con Agrobacterium con 10 M de MG132 (EMD Millipore) o 10 mM lactacistina (Sigma-Aldrich) o maqueta tratar la hoja con los respectivos disolventes, es decir, 0,1% de DMSO o agua destilada. </li></ol> 2. Preparación de extractos libres de células <ol><li> La cosecha de la hoja Recoger las áreas inoculadas de la hoja, por lo general aprox. 200-400 mg de peso fresco, y se muelen en un polvo fino en nitrógeno líquido. Alternativamente, bead-vencer a los tejidos, el uso de cualquier grano-batidor (por ejemplo, Biospec) o un amalgamador dental (por ejemplo, TPC Advanced<html> Technologies) directamente en el búfer de degradación (véase el paso 2.2). </li><li> La extracción de proteínas Preparar el extracto de proteína total mediante la colocación del tejido molido en 500 l de tampón de degradación de [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl 2, DTT 5 mM, adenosina 5 mM 5&#39;-trifosfato, y el inhibidor de la proteasa 1x cóctel (Sigma-Aldrich)]. Tenga en cuenta que el cóctel inhibidor de la proteasa afecta principalmente serina, cisteína, aspártico, y metaloproteasas y no interfiere con la proteasa 26S. Aclarar el extracto mediante dos centrifugaciones secuenciales a 12.000 xg durante 5 min. </li><li> Reacción de degradación de proteínas Transferencia de volúmenes iguales de extractos de, por lo general 20 l, para microcentrífuga tubos e incubar a temperatura ambiente para aumentar los períodos de tiempo. Típicamente, tiempo de la muestra cero, y 5, 10, 15, 20, y 30 puntos de tiempo min. Deje de reacciones por ebullición en SDS-gel tampón de la muestra, y analizarlos por el Western Blot. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Detección de la degradación de proteínas por inmunotransferencia <ol><li> La electroforesis en gel 3.1.1 resolver el muestras de proteína mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y electrotransferencia las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con el protocolo estándar 30. 3.1.2 Determinar la concentración de proteína por el método de Bradford (Bio-Rad), y la carga de 50 a 80 g de proteína total por carril. Asegúrese de que todas las muestras se cargan por igual. Para los controles de carga, comparar las intensidades de una especie de proteína ubicua, tales como putativo Rubisco grandes cadenas que migran como una banda principal con una movilidad electroforética relativa de alrededor de 50 kDa, ya que pueden ser detectados en geles teñidos de azul de Coomassie o en Ponceau S-o fluorescente SYPRO Rubí teñido con membranas de nitrocelulosa. </li><li> Bloqueo Bloquear la membrana con 5% de leche descremada en TBST (Tris-HCl 10, NaCl 140 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) durante 1 h a temperatura ambiente. </li&gt; <li> El anticuerpo primario Diluir anticuerpo anti-epítopo principal en 1% de leche descremada en TBST a la concentración recomendada por el fabricante y se incuba con la membrana se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 º C con agitación suave. </li><li> Enjuague Enjuague la membrana se enjuagó en 20 ml de TBST durante 15 min una vez, y dos veces durante 5 min a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> El anticuerpo secundario Diluir anticuerpo secundario (por ejemplo, anti-IgG de conejo) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en 1% de leche descremada en TBST como se recomienda por el fabricante y se incuba con la membrana durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Detección Enjuague la membrana de nuevo como se describe en el Paso 3.4. Después del enjuague final en TBST, visualizar las proteínas de interés con un sustrato quimioluminiscente de HRP, más comúnmente usando un kit ECL. </li></ol>

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R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens.">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li><li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling.">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li><li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily.">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li><li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1/2+axis.">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. 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Biol. 11, 258-262 (2001).</li><li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity.">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium.">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li><li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway.">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tome-1,+a+trigger+of+mitotic+entry,+is+degraded+during+G1+via+the+APC.">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li><li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo.">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector.">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li><li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP/Slimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase.">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li><li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSAT+vectors:+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants.">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li><li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units.">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li><li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells.">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome:+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms.">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li><li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin.">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li><li>Ausobel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3/LOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses).">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este ensayo se basa en la expresión de las proteínas de la prueba en tejidos de la planta, por lo tanto, el potencial proceso de degradación proteasomal, obviamente, se produce ya dentro de los tejidos vivos. Nosotros ensayamos la desestabilización de proteínas, sin embargo, sólo en los extractos, con el tiempo de la muestra cero que sirve como el punto de referencia inicial. Por lo tanto, se define como un ensayo libre de células. Un aspecto importante para el éxito de este ensayo e...

La vía del proteasoma ubiquitin/26S está emergiendo como un mecanismo generalizado para el control de diversas reacciones biológicas, incluyendo la regulación transcripcional, la progresión del ciclo celular y la transducción de la señal, el receptor de baja regulación o endocitosis, entre otros procesos de 1-4. En esta vía, la proteína diana se marca por ubiquitina residuos que se unen primero a través de un enlace tioléster de enzima ubiquitina-activación de E1 y luego trasladadas a un residuo de aminoácido cisteína de la enzima ubiquitina-conjugación E2; finalmente, E2 interactúa con ubiquitina ligasa E3 , lo que resulta en polyubiquitination del sustrato proteína. En última instancia, las proteínas polyubiquitinated son reconocidos y degradados por el proteasoma 26S. En este mecanismo, la enzima E3 especifica el sustrato y actúa como el componente regulador clave del sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasas E3 pueden actuar independientemente, tales como ligasas de dominio ANILLO, o como parte de un SCF de múltiples subunidades (Skp1/Cullin/F-box proteína) compleja, como ligasas de dominio F-box. Vías de degradación proteasomal mediadas por SCF están involucrados en la regulación de la transcripción, el ciclo celular, la transducción de señal de 5-10 y muchas otras funciones celulares importantes. Además de estos papeles críticos en la regulación de procesos celulares, UPS toma el escenario central en muchas de las interacciones planta-patógeno. Por ejemplo, el aumento de la evidencia sugiere que varios patógenos de plantas, incluyendo Agrobacterium tumefaciens, se basan en la acogida de UPS para facilitar el proceso de infección 11. Agrobacterium provoca crecimientos neoplásicos en las plantas, que representan sus huéspedes naturales, y también puede transformar una amplia gama de otros eucariotas, a partir de hongos 1,2 a las células humanas 12,13. Durante su infección, de Agrobacterium exporta un elemento de ADN (ADN-T) y varios virulencia (Vir) las proteínas en la célula huésped 12-13. Una de estas proteínas es VirF, la primera proteína F-box encontradopara ser codificada por un genoma procariota 14. Como parte del complejo SCF ubiquitina ligasa, VirF, y su homólogo anfitrión funcional VBF 15, facilitar la infección de Agrobacterium a través de la degradación de proteínas mediada por la UPS, que presumiblemente facilita uncoating de la T-ADN bacteriano invasor de sus acompañan proteínas bacterianas y de acogida, VirE2 y VIP1, respectivamente 16,17. Curiosamente, muchas proteínas F-box, incluyendo VirF, son intrínsecamente inestables debido a su propia proteólisis, que está mediada por la actividad autoubiquitination 18,19 o por otras ligasas E3 para el que F-box proteínas pueden servir como sustratos 20-23. Al estudiar las actividades bioquímicas de las proteínas F-box, otras ligasas de ubiquitina, y / o sus sustratos, sería muy útil emplear un ensayo sencillo y fiable para la degradación proteasomal. Aquí se describe un protocolo de este tipo para el análisis de estabilidad de la proteína en una célulaSin sistema. En este ensayo, la estabilidad del sustrato de UPS se analiza en la presencia o ausencia de uno de los componentes esenciales de la vía de degradación proteasomal, tales como una proteína de la caja F, en un sistema libre de células. En general, expresamos la proteína (s) ensayados en los tejidos vegetales, preparar los extractos libres de células de estos tejidos y controlar las cantidades de la proteína (s) de interés por el Western Blot. El mecanismo de la UPS dependientes de la degradación de proteínas se demostró mediante la inclusión de inhibidores de proteasomal específicos y / o el uso de co-expresión de la forma dominante negativa de un componente de SCF, Cullin. Considerando que ilustramos este ensayo usando la degradación proteasomal de la proteína de Arabidopsis VIP1 17 por la proteína F-box VBF 15, que se puede emplear para investigar la estabilidad de los otros sustratos proteasomal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Protein assay kit</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Proteinase inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mini-Protean system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Semi-dry western blotting SD electrotransfer system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td>
			<td style="width:129px;">icllab</td>
			<td>RHGT-45A-Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate</td>
			<td style="width:129px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane</td>
			<td style="width:129px;">Pall Corportation</td>
			<td style="width:119px;">27377-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MG132</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td>474790-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td>
			<td style="width:129px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">35055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying proteasomal degradation in a cell-free system in plants

La vía de la ubiquitina-proteasoma para la degradación de proteínas se ha convertido en uno de los mecanismos más importantes para la regulación de una amplia gama de funciones celulares en prácticamente todos los organismos eucariotas. Específicamente, en las plantas, el sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regula la degradación de proteínas y contribuye significativamente al desarrollo de una amplia gama de procesos, incluyendo la respuesta inmune, desarrollo y muerte celular programada. Por otra parte, cada vez más evidencia sugiere que numerosos patógenos de las plantas, tales como Agrobacterium, explotan la acogida de UPS para la infección eficiente, haciendo hincapié en la importancia de la UPS en las interacciones planta-patógeno. La especificidad de sustrato de la UPS se consigue mediante la ubiquitina ligasa E3 que actúa en concierto con la E1 y E2 ligasas para reconocer y marcar moléculas de proteínas específicas destinadas a la degradación por unir a ellos cadenas de moléculas de ubiquitina. Una clase de las ligasas E3 es el SCF (Skp1 / Cproteína ullin / F-box) compleja, que reconoce específicamente los sustratos de UPS y los dirige a través de su componente de ubiquitinación de proteínas F-box. Para investigar un posible papel de la UPS en un proceso biológico de interés, es importante para idear un ensayo simple y fiable para la degradación de proteínas mediada por UPS. Aquí, se describe uno de tales ensayo utilizando un sistema libre de células de la planta. Este ensayo se puede adaptar para el estudio de las funciones de la degradación de proteínas regulado en diversos procesos celulares, con un enfoque especial en los F-box interacciones proteína-sustrato.

La Figura 1, adaptado de Zaltsman et al. 17, ilustra experimentos representativos para la detección de la degradación proteasomal en un sistema libre de células. En concreto, se demuestra la desestabilización de una planta relacionada con la defensa de proteínas VIP1 por la proteína F-box VBF través de la vía SCF VBF en N. benthamiana. VBF Arabidopsis y HA-etiquetados VIP1 (HA-VIP1) proteínas se coexpresan transitoriamente, y la proteín...

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Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven &quot;etiquetas&quot; como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas.

Ensayo Proteasomal degradación en un sistema libre de células en las plantas

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K vistas.  Stony Brook University, State University of New York.  Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven "etiquetas" como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas. 

Video: Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

El mantenimiento de Wolbachia en medio libre de células

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Investigación

Biología

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Un protocolo simple para mapear los rasgos de arquitectura del sistema radicular de la planta

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Cuantificación de la infiltración grasa del músculo esquelético mediante descelularización

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autor destacado: Cuantificación basada en la descelularización de la infiltración grasa del músculo esquelético  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.

Cuantificación basada en la descelularización de la infiltración grasa del músculo esquelético

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

Incorporación de reacciones de CFPS en una variedad de matrices de hidrogel

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Autor destacado: Un enfoque novedoso para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles 

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...