Cette vidéo montre comment évaluer l’immunogénicité in vivo des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs, ou VE, à l’aide de la cytométrie en flux. La méthode de dépistage décrite ici est relativement facile à réaliser et peut être adaptée à divers contextes. Dans le cancer, l’identification des conditions de libération de vésicules extracellulaires immunogènes présente une pertinence translationnelle particulière.
En tant que tels, les ve électriques autologues peuvent être utilisés comme traitements anticancéreux personnalisés. La démonstration de la première partie de la procédure sera assurée par Tatiana Nedelko, une assistante technique de mon laboratoire. Pour commencer la préparation des milieux de culture cellulaire nécessaires aux vésicules extracellulaires, ou VE, épuiser les VE bovins dans les milieux FCS par ultracentrifugation à 100 000 fois g pendant 24 heures à 4 degrés Celsius.
Jeter la pastille après centrifugation. Prélever les cellules de mélanome B16 murin exprimant l’ovalbumine, ou cellules B16-OVA, de la culture et laver les cellules deux fois avec PBS. Ensuite, ensemencez les cellules à une concentration de 400 000 cellules par millilitre dans le milieu appauvri en EV.
Ensuite, traitez les cellules B16-OVA avec 30 microgrammes d’oxaliplatine par millilitre et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec des échantillons témoins non traités. Après 24 heures, prélever le surnageant pour centrifuger à 400 fois g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Jeter à nouveau la pastille avant la centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius.
Après avoir jeté la pastille, filtrez le surnageant à travers un filtre à membrane PVDF de 220 nanomètres dans un tube frais. Ensuite, mélangez 1 millilitre de surnageant avec 0,5 millilitre d’un réactif d’isolement d’exosome spécifique disponible dans le commerce. Vortex et transférer le mélange dans des tubes de 1,5 millilitre, suivis d’une incubation nocturne à 4 degrés Celsius.
Le lendemain, centrifuger le mélange à 10 000 fois g pendant 60 minutes à 4 degrés Celsius. Après avoir soigneusement jeté le surnageant, retirez les gouttes restantes en tapotant le tube de 1,5 millilitre à l’envers sur une serviette en papier et en aspirant à travers une fine pointe de pipette sans toucher la pastille EV au fond. Remettez en suspension la pastille dans du PBS froid en pipetant de haut en bas sans rayer la pastille avec la pointe.
Ensuite, mettez en commun les véhicules électriques de tous les tubes. Si vous ne les utilisez pas immédiatement, conservez les suspensions EV à 80 degrés Celsius dans des récipients siliconés jusqu’à 28 jours jusqu’à l’application. Pour immuniser chaque souris du groupe de traitement avec des VE isolés de 4,0 x 10 à la cinquième cellule B16-OVA, mélanger 5 microlitres de la suspension EV avec 55 microlitres de PBS froid.
Ensuite, remplissez les seringues montées avec des aiguilles de calibre 26 à 30 avec 60 microlitres des VE dilués ou pbS, puis mettez immédiatement la seringue sur de la glace. Inoculez les VE ou pbS par voie sous-cutanée dans l’aspect médian de la cuisse de la souris. Répétez l’immunisation après sept jours.
14 jours après le premier traitement, sacrifiez les souris pour réséquer la rate. Ensuite, écrasez la rate réséquée avec une passoire à cellules humidifiée de 100 micromètres et le piston en plastique d’une seringue. Rincez les cellules spléniques dans un tube de 50 millilitres avec 5 à 10 millilitres du RPMI complet froid.
Ensuite, centrifugez les cellules à 400 fois g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius avant de jeter le surnageant. Pour retirer les érythrocytes de la suspension cellulaire, remettez en suspension et incubez la pastille cellulaire avec 2 millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant cinq à 10 millilitres de RPMI complet, suivi d’une centrifugation comme décrit précédemment.
Après avoir remis en suspension la pastille cellulaire dans un RPMI complet, comptez les cellules de chaque souris et placez les triples de 200 000 splenocytes avec 200 microlitres de cRPMI dans chaque puits d’une plaque de 96 puits avec un fond en forme de U. Ensuite, incubez les plaques pendant 48 heures à 37 degrés Celsius. Après 48 heures, traiter la culture cellulaire avec 5 nanogrammes par millilitre brefeldine A, 20 nanogrammes par millilitre PMA et 1 microgramme par millilitre ionomycine à 37 degrés Celsius pendant 4 heures.
Après l’incubation, transférez les splenocytes dans une plaque de 96 puits avec un fond en forme de V et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Remettre en suspension les splenocytes granulés dans la solution de coloration fraîchement préparée et incuber la suspension cellulaire pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius à l’abri de la lumière. Pour la fixation et la perméabilisation, lavez les splenocytes deux fois dans le tampon FACS, puis remettez en suspension les splenocytes dans 100 microlitres par puits de la solution de fixation et de perméabilisation, suivie d’une incubation dans l’obscurité comme expliqué précédemment.
Pour colorer l’interféron gamma intracellulaire, laver les splenocytes dans le tampon de fixation ou de perméabilisation avant de renvoyer les cellules avec les anticorps fluorescents contre l’interféron gamma dilué 1:200 dans le tampon. Incuber les splenocytes pendant 1 à 12 heures à 4 degrés Celsius dans l’obscurité. Après un lavage et une remise en suspension approfondis dans un tampon FACS, analysez l’activation des lymphocytes T cytotoxiques selon la stratégie de contrôle expliquée dans le manuscrit.
Dans l’image représentative, la stratégie de contrôle pour analyser l’activation des lymphocytes T cytotoxiques est affichée. Les cellules ont été fermées en tant que cellules individuelles, le sous-ensemble de lymphocytes, les lymphocytes T CD3 positifs viables et les lymphocytes T cytotoxiques CD8 positifs CD4 négatifs. L’accumulation intracellulaire de l’interféron gamma a été évaluée comme marqueur de substitution pour l’activation.
Après l’immunisation avec des VE dérivés des cellules tumorales, l’induction de réponses de lymphocytes T spécifiques à l’antigène chez les souris receveuses a été étudiée. Les VE dérivés de tumeurs cultivés dans des conditions de stress génotoxiques, telles que le traitement à l’oxaliplatine, ont induit une activation puissante des lymphocytes T cytotoxiques spléniques contrairement aux VE non traités. Le groupe d’animaux traités par véhicule a montré la réponse la plus faible.
L’activation des lymphocytes T spléniques a été déterminée après la restimulation ex vivo en présence ou en l’absence d’ovalbumine. La production de l’interféron gamma a été augmentée lorsque les splénocytes d’animaux traités par EV tumoraux ont été restimulés avec l’antigène tumoral modèle ovalbumine avant l’analyse. Veuillez noter que les résultats reproductibles reposent sur l’efficacité constante de l’isolement des VE.
Ainsi, assurez-vous que les granulés de VE sont remis en suspension entièrement et rapidement pour éviter la dessiccation. Avec ce protocole, nous avons pu analyser des voies spécifiques dans les cellules tumorales qui déterminent l’immunogénicité des VE dérivés de cellules tumorales. Cela pourrait ouvrir la voie à l’exploitation de ces VE immunogènes dans le traitement du cancer.
