このビデオは、フローサイトメトリーを使用して、腫瘍由来の細胞外小胞(EV)のin vivo免疫原性を評価する方法を示しています。本明細書に記載されるスクリーニング方法は、比較的容易に実施でき、様々な設定に適合させることができる。癌において、特に翻訳的関連性の免疫原性細胞外小胞放出の条件を同定する。
そのため、自家製EVはパーソナライズされた抗がん治療として使用される可能性があります。手順の最初の部分を実演するのは、私の研究室の技術助手であるTatiana Nedelkoです。細胞外小胞またはEVに必要な細胞培養培地の調製を開始するには、FCS培地中のウシEVを100,000倍gで摂氏4度で24時間超遠心分離することによって枯渇させる。
遠心分離後にペレットを捨てる。培養物からオボアルブミンを発現するマウスB16メラノーマ細胞、またはB16-OVA細胞を回収し、PBSで細胞を2回洗浄する。次いで、EV枯渇培地中に1ミリリットル当たり400,000細胞の濃度で細胞を播種する。
次に、B16-OVA細胞を1ミリリットルあたり30マイクログラムのオキサリプラチンで処理し、未処理の対照サンプルと共に摂氏37度で24時間インキュベートする。24時間後、上清を回収し、摂氏4度で5分間、400倍gで遠心分離する。ペレットを捨てる前に、摂氏4度で2,000倍gで30分間再度遠心分離する。
ペレットを廃棄した後、上清を220ナノメートルPVDFメンブレンフィルターを通して新鮮なチューブにろ過する。次いで、1ミリリットルの上清を、特定の市販のエキソソーム単離試薬の0.5ミリリットルと混合する。ボルテックスおよび混合物を1.5ミリリットルのチューブに移し、続いて摂氏4度で一晩インキュベートした。
翌日、混合物を摂氏4度で60分間、10,000倍gで遠心分離する。上澄み液を慎重に捨てた後、ペーパータオルの上で1.5ミリリットルのチューブを逆さまに叩き、底部のEVペレットに触れることなくピペットの細かい先端を通して吸引することによって、残りの滴を取り除きます。ペレットを先端で引っ掻くことなく上下にピペッティングすることにより、ペレットを冷たいPBSに再懸濁する。
次に、すべてのチューブからEVをプールします。すぐに使用しない場合は、EVサスペンションを80°Cでシリコン処理容器に塗布するまで最大28日間保管してください。4.0 x 10から5番目のB16-OVA細胞に単離されたEVで治療群の各マウスを免疫するには、5マイクロリットルのEV懸濁液を55マイクロリットルの冷PBSと混合する。
次に、26~30ゲージの針を装着したシリンジに60マイクロリットルの希釈EVまたはPBSを充填し、直ちにシリンジを氷上に置きます。EVまたはPBSをマウスの大腿部の内側側面に皮下に接種する。7日後に予防接種を繰り返す。
最初の処置の14日後、マウスを屠殺し、脾臓を切除した。次に、切除した脾臓を湿らせた100マイクロメートルのセルストレーナーとシリンジのプラスチックプランジャーでマッシュアップします。脾臓細胞を50ミリリットルのチューブに5〜10ミリリットルの冷却完全RPMIでフラッシュします。
次に、細胞を400倍gで4°Cで5分間遠心分離してから上清を捨てる。細胞懸濁液から赤血球を除去するために、細胞ペレットを再懸濁し、2ミリリットルの赤血球溶解緩衝液と共に室温で5分間インキュベートする。次いで、5〜10ミリリットルの完全RPMIを加えて反応を停止し、続いて前述のように遠心分離を行った。
細胞ペレットを完全なRPMIで再懸濁した後、すべてのマウスからの細胞をカウントし、200マイクロリットルのcRPMIを含む200,000の脾細胞の3連を、底部がU字型を有する96ウェルプレートの各ウェルに入れる。その後、プレートを摂氏37度で48時間インキュベートする。48時間後、細胞培養物を、1ミリリットルあたり5ナノグラムのブレフェルジンA、1ミリリットルあたり20ナノグラムのPMA、および1ミリリットルあたり1マイクログラムのイオノマイシンで摂氏37度で4時間処理する。
インキュベーション後、脾細胞を底部がV字型である96ウェルプレートに移し、PBSで細胞を2回洗浄した。ペレット状の脾細胞を新たに調製した染色溶液に再懸濁し、細胞懸濁液を光から保護された摂氏4度で30分間インキュベートする。固定および透過処理のために、FACS緩衝液で脾細胞を2回洗浄し、次いで脾細胞を固定および透過処理溶液のウェルあたり100マイクロリットルで再懸濁し、続いて前述のように暗闇中でインキュベーションする。
細胞内インターフェロンγを染色するために、脾細胞を固定または透過処理バッファーで洗浄してから、バッファーで1:200に希釈したインターフェロンγに対する蛍光抗体で細胞を再送する。脾細胞を暗所で摂氏4度で1〜12時間インキュベートする。FACS緩衝液中での徹底的な洗浄および再懸濁の後、原稿で説明されたゲーティング戦略に従って細胞傷害性T細胞の活性化を分析する。
代表画像では、細胞傷害性T細胞の活性化を分析するためのゲーティング戦略が表示されている。細胞を単一細胞、リンパ球サブセット、生存可能なCD3陽性T細胞、およびCD4陰性CD8陽性細胞傷害性T細胞としてゲーティングした。インターフェロンγの細胞内蓄積を、活性化のための代理マーカーとして評価した。
腫瘍細胞に由来するEVsによる免疫後、レシピエントマウスにおける抗原特異的T細胞応答の誘導が検討された。オキサリプラチン処理などの遺伝毒性ストレス条件下で培養された腫瘍由来EVsは、未処理のEVとは対照的に脾臓細胞傷害性T細胞の強力な活性化を誘導した。ビヒクル処置群の動物は、最も低い応答を示した。
脾臓T細胞の活性化は、オボアルブミンの存在下または非存在下のいずれかでのエクスビボ再刺激後に決定した。インターフェロンγの産生は、腫瘍EV処置動物の脾細胞を、分析前にモデル腫瘍抗原オボアルブミンで再刺激したときに増加した。再現可能な結果は、EVの一定の絶縁効率に依存することに注意してください。
したがって、乾燥を避けるために、EVペレットが完全かつ迅速に再懸濁されていることを確認してください。このプロトコールにより、腫瘍細胞由来EVの免疫原性を決定する腫瘍細胞内の特定の経路を解析することができました。これは、このような免疫原性EVをがん治療に活用する道を開くかもしれない。
