이 비디오는 유세포 분석기를 사용하여 종양 유래 세포밖 소포 또는 EVs의 생체내 면역원성을 평가하는 방법을 보여준다. 본원에 기재된 스크리닝 방법은 비교적 수행이 용이하고 다양한 설정에 적응될 수 있다. 암에서, 특정 번역 관련성의 면역원성 세포밖 소포 방출의 상태를 확인한다.
따라서 자가 EV는 개인화 된 항암 치료제로 사용될 수 있습니다. 절차의 첫 번째 부분을 시연하는 것은 내 실험실의 기술 조수 인 Tatiana Nedelko입니다. 세포밖 소포 또는 EVs에 필요한 세포 배양 배지의 제조를 시작하기 위해, 섭씨 4도에서 24시간 동안 100, 000배 g에서 초원심분리에 의해 FCS 배지에서 소 EV를 고갈시킨다.
원심분리 후 펠렛을 버린다. 배양물로부터 오브알부민 또는 B16-OVA 세포를 발현하는 뮤린 B16 흑색종 세포를 수확하고, PBS로 세포를 두 번 세척한다. 이어서, 세포를 EV 고갈 배지에서 밀리리터 당 400, 000 세포의 농도로 시드한다.
다음으로, B16-OVA 세포를 밀리리터 당 30마이크로그램의 옥살리플라틴으로 처리하고, 처리되지 않은 대조군 샘플로 섭씨 37도에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 24시간 후, 상층액을 수집하여 섭씨 4도에서 5분 동안 400배 g에서 원심분리한다. 펠렛을 다시 원심분리하기 전에 폐기하고 섭씨 4도에서 30분 동안 2, 000회 g에서 폐기한다.
펠렛을 폐기한 후, 상층액을 220 나노미터 PVDF 멤브레인 필터를 통해 신선한 튜브로 여과한다. 이어서, 1 밀리리터의 상청액을 상업적으로 이용가능한 특정 엑소좀 분리 시약의 0.5 밀리리터와 혼합한다. 소용돌이 혼합물을 1.5 밀리리터 튜브 내로 옮기고, 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음날, 혼합물을 섭씨 4도에서 60분 동안 10, 000배 g에서 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 버린 후, 종이 타월에 1.5 밀리리터 튜브를 거꾸로 두드리고, 바닥의 EV 펠릿을 만지지 않고 피펫의 미세한 끝을 통해 흡인하여 나머지 방울을 제거하십시오. 펠릿을 팁으로 긁지 않고 위아래로 피펫팅하여 차가운 PBS에 펠렛을 재현탁시킨다.
그런 다음 모든 튜브에서 EV를 풀링합니다. 즉시 사용하지 않을 경우, EV 서스펜션을 실리콘 용기에 섭씨 80도에서 도포할 때까지 최대 28일 동안 보관하십시오. 4.0 x 10에서 단리된 EVs로 처리군의 각 마우스를 5번째 B16-OVA 세포로 면역화시키기 위해, 5 마이크로리터의 EV 현탁액을 55 마이크로리터의 차가운 PBS와 혼합한다.
다음으로, 26 내지 30 게이지 바늘로 장착된 주사기를 희석된 EV 또는 PBS의 60 마이크로리터로 채운 다음, 즉시 주사기를 얼음 위에 놓는다. EV 또는 PBS를 마우스의 허벅지의 내측 측면에 피하 접종한다. 칠일 후에 예방 접종을 반복하십시오.
첫 번째 치료 14 일 후, 비장을 절제하기 위해 마우스를 희생시킨다. 그런 다음 절제된 비장을 축축한 100마이크로미터 세포 스트레이너와 주사기의 플라스틱 플런저로 으깬다. 비장 세포를 5 ~ 10 밀리리터의 차가운 완전한 RPMI로 50 밀리리터 튜브에 플러시하십시오.
다음으로, 상층액을 버리기 전에 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 400회 g에서 원심분리한다. 세포 현탁액으로부터 적혈구를 제거하기 위해, 세포 펠릿을 실온에서 5분 동안 적혈구 용해 완충액 2 밀리리터와 함께 재현탁하고 인큐베이션한다. 이어서, 다섯 내지 10 밀리리터의 완전한 RPMI를 첨가하여 반응을 중지시키고, 이어서 앞서 기술한 바와 같이 원심분리하였다.
세포 펠릿을 완전한 RPMI에 재현탁시킨 후, 모든 마우스로부터의 세포를 계수하고, 200 마이크로리터의 cRPMI를 갖는 200, 000 개의 비장세포의 삼중항을 U자형 바닥을 갖는 96-웰 플레이트의 각 웰에 놓는다. 이어서, 플레이트를 섭씨 37도에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 48시간 후, 세포 배양물을 섭씨 37도에서 밀리리터 브레펠딘 A당 5나노그램, 밀리리터 PMA 당 20나노그램, 및 밀리리터 이오노마이신 당 1마이크로그램으로 4시간 동안 처리하였다.
인큐베이션 후, 비장세포를 V자형 바닥을 갖는 96-웰 플레이트로 옮기고 PBS로 세포를 두 번 세척한다. 펠릿화된 비장세포를 갓 제조된 염색 용액에 재현탁시키고, 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 30분 동안 세포 현탁액을 인큐베이션한다. 고정 및 투과를 위해, 비장세포를 FACS-완충액에서 두 번 세척한 다음, 비장세포를 고정 및 투과 용액의 웰 당 100 마이크로리터에 재현탁시키고, 이어서 앞서 설명된 바와 같이 어둠 속에서 인큐베이션하였다.
세포내 인터페론 감마를 염색하기 위해, 비장세포를 고정 또는 투과화 완충액에서 1:200으로 희석된 인터페론 감마에 대한 형광 항체로 세포를 재전송하기 전에 세척한다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 1 내지 12시간 동안 비장세포를 배양한다. FACS-버퍼에서 철저한 세척 및 재현탁 후, 원고에 설명된 게이팅 전략에 따라 세포독성 T 세포의 활성화를 분석한다.
대표적인 이미지에서, 세포독성 T 세포의 활성화를 분석하기 위한 게이팅 전략이 표시된다. 세포를 단일 세포, 림프구 서브세트, 생존가능한 CD3 양성 T 세포, 및 CD4 음성 CD8 양성 세포독성 T 세포로서 게이팅하였다. 인터페론 감마의 세포내 축적은 활성화를 위한 대리 마커로서 평가되었다.
종양 세포로부터 유래된 EVs로 면역화시킨 후, 수용자 마우스에서 항원 특이적 T 세포 반응의 유도를 연구하였다. 옥살리플라틴 처리와 같은 유전독성 스트레스 조건 하에서 배양된 종양 유래 EVs는 처리되지 않은 EVs와는 대조적으로 비장 세포독성 T 세포의 강력한 활성화를 유도하였다. 비히클 처리된 동물군은 가장 낮은 반응을 보였다.
비장 T 세포의 활성화는 난알부민의 존재 또는 부재 하에 생체외 재자극 후에 결정되었다. 인터페론 감마의 생산은 종양 EV 처리된 동물의 비장세포가 분석 전에 모델 종양 항원 오브알부민으로 재자극되었을 때 증가하였다. 재현 가능한 결과는 EV의 지속적인 분리 효능에 의존한다는 점에 유의하십시오.
따라서 건조를 피하기 위해 EV 펠릿을 완전하고 신속하게 재현탁하십시오. 이 프로토콜을 통해 우리는 종양 세포 유래 EV의 면역원성을 결정하는 종양 세포 내의 특정 경로를 분석 할 수있었습니다. 이것은 암 치료에서 이러한 면역원성 EV를 활용하는 길을 열어 줄 수 있습니다.
