Este vídeo mostra como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas do tumor, ou EVs, usando citometria de fluxo. O método de triagem descrito aqui é relativamente fácil de executar e pode ser adaptado a várias configurações. No câncer, identificando condições de liberação de vesícula extracelular imunogênica de particular relevância translacional.
Como tal, os EVs autólogos podem ser usados como tratamentos anticâncológicos personalizados. Demonstrando a primeira parte do procedimento estará Tatiana Nedelko, assistente técnica do meu laboratório. Para iniciar a preparação da mídia de cultura celular necessária para vesícula extracelular, ou EVs, esgotar os EVs bovinos em mídia FCS por ultracentrifugação a 100.000 vezes g por 24 horas a 4 graus Celsius.
Descarte a pelota após a centrifugação. Colher as células de melanoma murina B16 expressando ovalbumina, ou células B16-OVA, da cultura e lavar as células duas vezes com PBS. Em seguida, semeou as células a uma concentração de 400.000 células por mililitro na mídia esgotada pelo EV.
Em seguida, trate as células B16-OVA com 30 microgramas de oxaliplatina por mililitro e incubar por 24 horas a 37 graus Celsius com amostras de controle não tratadas. Depois de 24 horas, colecione o supernatante para centrífuga a 400 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Descarte a pelota antes da centrifugação novamente a 2.000 vezes g por 30 minutos a 4 graus Celsius.
Depois de descartar a pelota, filtre o sobrenante através de um filtro de membrana PVDF de 220 nanômetros em um tubo fresco. Em seguida, misture 1 mililitro de supernascente com 0,5 mililitros de um reagente de isolamento exosome disponível comercialmente específico. Vórtice e transfira a mistura em tubos de 1,5 mililitro, seguido de incubação durante a noite a 4 graus Celsius.
No dia seguinte, centrifufique a mistura a 10.000 vezes g por 60 minutos a 4 graus Celsius. Depois de descartar cuidadosamente o supernasce, remova as gotas restantes tocando o tubo de 1,5 mililitro de cabeça para baixo em uma toalha de papel e por aspiração através de uma fina ponta de pipeta sem tocar na pelota EV na parte inferior. Resuspenque a pelota em PBS frio, estocando para cima e para baixo sem arranhar a pelota com a ponta.
Em seguida, acumule os EVs de todos os tubos. Se não estiver usando imediatamente, armazene as suspensões EV a 80 graus Celsius em vasos siliconizados por até 28 dias até a aplicação. Para imunizar cada camundongo no grupo de tratamento com EVs isolados de 4,0 x 10 para as quintas células B16-OVA, misture 5 microliters da suspensão EV com 55 microliters de PBS frio.
Em seguida, encha as seringas montadas com agulhas de 26 a 30 com 60 microliters dos EVs diluídos ou PBS e, em seguida, imediatamente colocar a seringa no gelo. Inocular os EVs ou PBS subcutâneamente no aspecto medial da coxa do camundongo. Repita a imunização após sete dias.
14 dias após o primeiro tratamento, sacrifique os ratos para resseccionar o baço. Em seguida, amasse o baço ressecado com um coador de células umedecida de 100 micrômetros e o êmbolo plástico de uma seringa. Jogue as células esplênicas em um tubo de 50 mililitros com 5 a 10 mililitros do RPMI completo.
Em seguida, centrifugar as células a 400 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius antes de descartar o supernante. Para remover os eritrócitos da suspensão celular, resuspendam e incubam a pelota celular com 2 mililitros do tampão de lise de glóbulos vermelhos por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, pare a reação adicionando cinco a 10 mililitros de RPMI completo, seguido de centrifugação como descrito anteriormente.
Depois de reutilizar a pelota de célula em RPMI completo, conte as células de cada rato e coloque os triplicados de 200.000 esplenócitos com 200 microliters de cRPMI em cada poço de uma placa de 96 poços com um fundo em forma de U. Em seguida, incubar as placas por 48 horas a 37 graus Celsius. Após 48 horas, trate a cultura celular com 5 nanogramas por mililitro Brefeldin A, 20 nanogramas por MILilitro PMA e 1 micrograma por mililitro ionomicina a 37 graus Celsius por 4 horas.
Pós incubação, transfira os esplenócitos para uma placa de 96 poços com um fundo em forma de V e lave as células duas vezes com PBS. Resuspenda os esplenócitos pelleted na solução de coloração recém-preparada e incubar a suspensão celular por 30 minutos a 4 graus Celsius protegidos da luz. Para fixação e permeabilização, lave os esplenócitos duas vezes no tampão FACS e, em seguida, resuspenda os esplenócitos em 100 microliters por poço da solução de fixação e permeabilização, seguido de incubação no escuro como explicado anteriormente.
Para colorir o gamma de interferon intracelular, lave os esplenócitos na fixação ou tampão de permeabilização antes de retransmite as células com os anticorpos fluorescentes contra interferon gama diluída 1:200 no buffer. Incubar os esplenócitos por 1 a 12 horas a 4 graus Celsius no escuro. Após lavagem minuciosa e resuspensão no tampão FACS, analise a ativação de células T citotóxica de acordo com a estratégia de gating explicada no manuscrito.
Na imagem representativa, a estratégia de gating para analisar a ativação de células T citotóxicas é exibida. As células foram fechadas como as células únicas, o subconjunto linfócito, as células T cd3 positivas viáveis, e as células T cd8-positivas CD4-negativos. O acúmulo intracelular do gama interferon foi avaliado como um marcador substituto para a ativação.
Após a imunização com EVs derivados das células tumorais, foi estudada a indução de respostas de células T específicas de antígeno em camundongos receptores. Os EVs derivados do tumor cultivados sob condições de estresse genotóxico, como o tratamento de oxaliplatina, induziram a ativação potente das células T citotóxicas esplênicas em contraste com EVs não tratados. O grupo de animais tratados com veículos apresentou a menor resposta.
A ativação das células T esplênicas foi determinada após a reimulação ex vivo, seja na presença ou ausência de ovalbumina. A produção do interferon gama foi aumentada quando os esplenócitos de animais tumorais tratados com EV foram repimulados com o modelo de antigenação ovalbumina antes da análise. Observe que os resultados reprodutíveis dependem da eficácia constante do isolamento dos EVs.
Assim, certifique-se de que as pelotas EV sejam resuspengiadas inteiramente e prontamente para evitar a dessecação. Com este protocolo, pudemos analisar caminhos específicos dentro das células tumorais que determinam a imunogenicidade dos EVs derivados de células tumorais. Isso pode pavimentar o caminho para aproveitar tais EVs imunogênicos no tratamento do câncer.
