Las nanopartículas proteicas autoensambladas, o SAPN, se pueden utilizar para desarrollar vacunas contra diversas enfermedades infecciosas. Este método que describimos aquí se puede utilizar para purificar, refoldear y caracterizar SAPN que contienen un paquete de seis hélices. Esta nanopartícula puede presentar antígenos triméricos en una conformación nativa.
Con ligeras modificaciones, este método se puede aplicar a otras construcciones innovadoras de vacunas SAPN. Además, puede ser fácilmente transferible a la producción a gran escala para ensayos clínicos. Para la lisis de E.coli cosechada que expresa el paquete de seis hélices SAPN, utilice una sonda con la salida de sonicación de 150 vatios con cuatro segundos de sonicación y seis segundos de descanso, para sonicar pellets bacterianos resuspendidos en 40 mililitros de imidazol-libre sobre el hielo durante cinco minutos.
Centrifugar el izado celular para generar un sobrenadante clarificado y transferir el sobrenadante a un matraz estéril de 150 mililitros. A continuación, lleve la muestra a un volumen final de 100 mililitros con tampón fresco libre de imidazol. Para aislar la proteína de interés, abra el software FPLC y haga clic en la opción Nuevo método.
En el menú Configuración del método, abra el menú desplegable Posición de columna y seleccione C1 Puerto 3. En el menú desplegable Se muestra por técnica, seleccione Afinidad. En el menú desplegable Tipo de columna, seleccione Otros, HisTrap HP y cinco mililitros.
Los cuadros Volumen de columna y Presión se establecerán automáticamente en los valores adecuados. Haga clic en Esquema del método y arrastre los botones Equilibrio y Aplicación de ejemplo, tres botones de lavado de columnas y Elución del menú emergente Biblioteca de fases junto a la flecha antes de cerrar el menú Biblioteca de fases. Haga clic en Equilibrio y establezca los valores enumerados en la tabla en Búfer inicial B, 4%Búfer final B, 4% y Volumen de columna, cinco.
Haga clic en Aplicación de ejemplo. En el cuadro Carga de muestra, haga clic en el botón de opción Inyectar muestra en columna con bomba de muestra y confirme que la casilla situada junto a Usar caudal de configuración de método está marcada en la casilla Inyección de muestra con bomba de sistema. Cambie el valor del cuadro Volumen a 100 mililitros y el Esquema de colección de fracciones a Habilitar.
Haga clic en el cuadro Usar tamaño de fracción de configuración de método y cambie el Tamaño de fracción a cuatro mililitros. Haga clic en el primer botón de lavado de columnas, establezca los valores enumerados en la tabla en Búfer inicial B, 4%Búfer final B, 4% y volumen de columna, 10. Haga clic en el cuadro Habilitar esquema de colección de fracciones y haga clic en Usar tamaño de fracción desde configuración de método.
Cambie el Tamaño de fracción a cuatro mililitros y haga clic en el segundo botón De lavado de columnas. Establezca los valores de la tabla en Búfer inicial B, 0%Búfer final B, 0% y Volumen de columna, cinco. Haga clic en el cuadro Habilitar esquema de colección de fracciones y haga clic en Usar tamaño de fracción desde configuración de método.
Cambie el Tamaño de fracción a cuatro mililitros y haga clic en el tercer botón de lavado de columnas. Establezca los valores de la tabla en Búfer inicial B, 0%Búfer final B, 0% y Volumen de columna, 10. Haga clic en el botón Habilitar esquema de colección de fracciones y haga clic en el cuadro Usar tamaño de fracción desde configuración de método.
A continuación, cambie el Tamaño de fracción a cuatro mililitros. Haga clic en el botón Elution y haga clic con el botón derecho en la información de la tabla. En el menú emergente, haga clic en Eliminar paso y arrastre el botón Degradado isocrático a la tabla dos veces, de modo que haya dos entradas.
Establezca el valor de la primera entrada en Búfer inicial B, 30%Búfer final B, 30% y Volumen de columna, 10. Establezca el valor de la segunda entrada en Búfer inicial B, 100%Búfer final B, 100% y Volumen de columna, 10. Haga clic en el botón Habilitar esquema de colección de fracciones y haga clic en el cuadro Usar tamaño de fracción desde configuración de método.
A continuación, haga clic en Guardar como y asigne un nombre a la purificación de archivos. Coloque la bomba Un tubo del FPLC en el tampón de lavado libre de imidazol y el tubo B de la bomba en el tampón de imidazol de 500 mililitros. Coloque el tubo de la bomba de muestra en la muestra de 100 mililitros y ejecute el programa de purificación.
Cuando se necesite el lavado 60%isopropanol, detenga el programa, mueva el tubo A de la lava sin imidazol al lavado 60%isopropanol y reinicie el programa. Al final del lavado, detenga el programa de nuevo, devuelva la bomba A tubo al tampón de lavado libre de imidazol y reinicie el programa de purificación. Para evaluar la pureza de la proteína purificada, primero combine las fracciones del flujo a través, lave una, lave dos y lave tres pasos, en tubos cónicos individuales de 50 mililitros.
A continuación, mezcle 15 microlitros de cada tubo de muestra con 15 microlitros de tamplio 2X Laemmli en tubos de microcentrífuga individuales de 0,5 mililitros y desnaturalizar las muestras a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Al final de la incubación, configure un aparato de funcionamiento de gel con tres geles de poliacrilamida prefabricados de cuatro a 20% prefabricados en el tampón de funcionamiento Tris-Glycine SDS-PAGE. Cargue ocho microlitros de marcador de peso molecular en el primer pozo de cada gel y 30 microlitros de muestra desnaturalada a los otros pozos.
Ejecute los geles a 200 voltios hasta que el frente del tinte llegue a la parte inferior del gel y enjuague brevemente los geles con agua desionizada antes de tomar imágenes inmediatamente con un sistema de imágenes sin manchas. A continuación, identifique las fracciones que contienen bandas de proteínas con el tamaño correcto y acoja estas fracciones. Para el plego de seis hélices SAPN, agregue de 10 a 20 mililitros de proteína agrupada a un casete de diálisis de peso molecular de 10 kilodalton.
Dializa el cassette en ocho urea molar, Tris de 20 mililitros, 5% glicerol y TCEP de cinco mililitrolares a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, disminuya la concentración de urea en el tampón de diálisis de forma escalonada en dos molares cada dos horas para dializar lentamente la urea fuera de la muestra. Cuando la concentración de urea alcance dos molares, mueva el aparato de diálisis a cuatro grados centígrados y marque la muestra en urea de 120 mililitros, Tris de 20 mililitros y 5% de glicerol durante la noche para terminar el plegado.
A la mañana siguiente, retire la proteína reombrada del cassette y filtre el paquete de seis hélices SAPN a través de un filtro de jeringa de fluoruro de polivinilideno de 0,22 micras. Para medir el tamaño medio de partícula del paquete de seis hélices SAPN, añada 45 microlitros de paquete de seis hélices SAPN a una cubeta desechable y coloque la cubeta en la máquina DLS. A continuación, cree un nuevo archivo de medición y ejecute un procedimiento operativo estándar preescrito para proteínas en urea de 120 mililitros, Tris de 20 mililitros y tampón de glicerol al 5% de glicerol a 25 grados centígrados.
A continuación, inicie la medición. El tamaño medio Z, la PDI y los resultados de distribución se calcularán para cada ejecución. La máquina leerá la muestra cinco veces.
Este paquete de seis hélices completamente ensamblado SAPN se basa en secuencias de proteínas que se prevé que se plieguen en una partícula que contiene 60 copias del monómero. El lisato celular total se utilizó para purificar los monómeros SAPN de seis hélices por FPLC utilizando una columna de níquel, lo que demuestra que la proteína eluía tanto en imidazol de 150 y 500 milpiés. El cromatograma también muestra otros dos picos en 185 y 210 mililitros de volumen total correspondiente al lavado de isopropanol y el lavado libre de imidazol respectivamente.
Las fracciones y la pureza de la proteína recombinante podrían identificarse mediante geles SDS-PAGE de gradiente con la proteína de interés ubicada principalmente en la fracción 68 a 79. El análisis de manchas occidentales con anticuerpos anti-his y anti-167D4 indicaba que las fracciones agrupadas eran de hecho la proteína de interés. Las manchas también demostraron la presencia del paquete de seis hélices SAPN multimers.
Las muestras que contenían los monómeros proteicos de interés se plegaron en el paquete de seis hélices completamente ensamblado SAPN por diálisis y distribución del tamaño de partícula fue determinado por el análisis de seguimiento de nanopartículas y DLS. La visualización por microscopía electrónica de transmisión reveló partículas SAPN de paquete individual de seis hélices bien formadas con la distribución del tamaño obtenida de las dos técnicas de tamaño de partículas. El paso más importante en este protocolo es el refolding del paquete de seis hélices SAPN.
El pH correcto y la fuerza iónica del tampón de plegado son esenciales. Usando un lavado de isopropanol durante la purificación, pudimos reducir la contaminación de LPS a un nivel muy bajo. Sin embargo, LPS se puede reducir aún más utilizando una columna de intercambio de aniones según sea necesario.
Esta tecnología se puede adaptar fácilmente para aplicaciones humanas. Ya se ha ampliado un SAPN expresado por bacterias para un ensayo clínico de malaria de próxima fase 1/2a.
