La calificación de discinesias inducidas por L-DOPA en el modelo de rata 6-hidroxidopamina de la enfermedad de Parkinson es una herramienta preclínica importante para identificar intervenciones antidiscinéticas efectivas. Este modelo es relativamente simple, presenta bajo costo y tiene similitudes con lo que sucede en la clínica. El procedimiento será demostrado por Danilo Leandro Ribeiro, estudiante de doctorado en el laboratorio.
Comience el experimento con ratas macho Sprague-Dawley, que pesan de 200 a 250 gramos. Aloje de dos a tres animales por jaula en las condiciones estándar de laboratorio con alimentos y agua disponibles ad libitum. Antes de la cirugía, administrar el inhibidor del transportador de norepinefrina, imipramina, a la rata por vía intraperitoneal.
Después de confirmar la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, coloque a la rata en posición prona en el aparato estereotáxico en la parte superior de la almohadilla térmica. Una vez que la rata esté posicionada, use un bisturí para hacer una incisión de un centímetro de largo en la región donde se producirá la microinyección. Luego, limpie la región del cráneo con hisopos de algodón y asegúrese de que el bregma y la lambda estén expuestos.
Tome el haz prosencéfalo medial, o MFB, coordenadas estereotáxicas de bregma a 4.3 milímetros anterior, 1.6 milímetros laterales al lado derecho y 8.3 milímetros ventral desde el durómetro. Cuando se decidan las coordenadas, administre la 6-hidroxidopamina, o 6-OHDA, unilateralmente a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto en el MFB derecho, con una jeringa de vidrio Hamilton de 50 microlitros. Al final de la cirugía, suture la incisión del cuero cabelludo y rehidrate al animal con solución salina tibia, estéril al 0,9% por vía subcutánea, a la dosis de 10 mililitros por kilogramo.
Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en una jaula de recuperación caliente, mientras monitorea hasta que se recupere la conciencia. A las cuatro semanas después de la lesión, medir la efectividad de la lesión dopaminérgica mediante una prueba de pasos, evaluando la acinesia de la extremidad anterior contralateral a la lesión. Las ratas que presenten tres o menos pasos de ajuste con la extremidad anterior contralateral deben incluirse en el estudio como ratas putativas, con lesión severa de 6-OHDA.
Cuatro semanas después de las lesiones de 6-OHDA, comience el tratamiento crónico el lunes y registre movimientos involuntarios anormales el miércoles. Para hacerlo, coloque a la rata dentro de un cilindro transparente con 20 centímetros de diámetro y 40 centímetros de altura, y deje que se aclimate durante al menos 15 minutos. Asegúrese de que el piso esté cubierto con el material de la cama y que los espejos estén colocados detrás del cilindro para observar al animal desde todos los ángulos posibles.
Coloque una cámara de video de alta resolución para permitir la visualización de movimientos involuntarios anormales axiales, de extremidades y orolinguales. Los espejos detrás del cilindro permitirán rastrear movimientos involuntarios anormales en un ángulo de 360 grados. La cámara se puede colocar ligeramente por debajo del avión en un ángulo de 15 grados de los animales para observar movimientos involuntarios anormales orolinguales.
Cuando se decida la posición, fije la cámara directamente al banco. Una vez que el animal esté aclimatado durante 15 minutos, retire al animal del cilindro y administre cinco miligramos por kilogramo de L-dopamina recién preparada o L-DOPA combinada con 12,5 miligramos por kilogramo de benserazida, por vía subcutánea. Vuelva a colocar al animal en el cilindro y encienda un temporizador para rastrear los movimientos involuntarios anormales.
Use una cámara de video para registrar los movimientos involuntarios anormales durante 180 minutos después de la inyección, a intervalos de 30 minutos, para llevar a cabo la puntuación fuera de línea. Después de los seis períodos de observación, los puntajes deben darse en épocas de uno a dos minutos y clasificarse como axiales, de extremidades u orolinguales. Asegúrese de no incluir comportamientos normales.
El tratamiento con L-DOPA y benserazida debe continuarse durante tres semanas, una vez al día, de lunes a viernes. En el análisis del curso del tiempo representativo, se muestran las puntuaciones aplicadas a los movimientos involuntarios anormales axiales, de las extremidades y orolinguales durante tres semanas de administración crónica de L-DOPA. Se observó que las discinesias de dosis máximas inducidas por L-DOPA ocurren entre 30 y 90 minutos, con una disminución gradual después de 120 minutos después de la inyección.
Además, la suma de los movimientos involuntarios anormales axiales, de las extremidades y orolinguales se presentó en individuos, anotando días y semanalmente durante tres semanas de administración crónica de L-DOPA. El protocolo de movimientos involuntarios anormales suele ser para la investigación de nuevas herramientas terapéuticas con potencial traslacional antidiscinético.
