Debido a que el pulmón alberga un sistema inmunológico muy complejo y único, se han desarrollado e informado varias estrategias de cierre para la identificación de células inmunes pulmonares. La existencia de varios enfoques diferentes dificulta la comparación de los resultados generados por diferentes laboratorios. Nuestra estrategia de cierre proporciona una forma integral y reproducible de identificar hasta 12 poblaciones inmunes mieloides pulmonares y no mieloides diferentes utilizando nueve marcadores.
El presente protocolo describe la caracterización e identificación de poblaciones inmunes pulmonares en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo se puede emplear para identificar cambios de estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad, donde puede ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad del panorama inmune pulmonar. Los investigadores que realizan esta técnica por primera vez deben prestar atención a las condiciones de digestión y los reactivos, ya que marcan una gran diferencia en la liberación de células inmunes del tejido pulmonar.
Comience por preparar al animal sacrificado para la cirugía. Estabilice el ratón dorsalmente usando agujas o cinta adhesiva en las cuatro extremidades, luego use etanol al 70% para desinfectar la piel del área ventral. Haga una incisión desde el cuello hasta el abdomen.
Retire la piel del área torácica, junto con las costillas y el esternón. Enjuague los pulmones inyectando 10 mililitros de PBS frío en el ventrículo derecho con una aguja de calibre 18 a 21 hasta que se vuelvan completamente blancos. Luego, retire el timo y el corazón sin tocar los pulmones.
Separe los pulmones de los tejidos circundantes y transfiéralos a un tubo que contenga tampón BSA frío. Transfiera el pulmón a una placa de Petri, pica con dos bisturíes finos y luego colóquelo en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue cinco mililitros de tampón de digestión para lavar el plato.
Asegure la tapa del tubo y digiera el pulmón durante 30 minutos en un agitador orbital a una velocidad de 150 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados. Detenga la reacción agregando 10 mililitros de tampón BSA frío. Después de la digestión, mezcle y disuelva las piezas pulmonares con una aguja de calibre 18.
Coloque un filtro de 70 micrómetros encima de un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y transfiera la mezcla pulmonar digerida al colador. Use el lado de goma de un émbolo de jeringa de 10 mililitros para romper las piezas pulmonares restantes en el filtro y lavarlo con tampón BSA. Centrifugar la suspensión unicelular a 350 G durante ocho minutos a siete grados centígrados.
Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de tampón de lisis ACK. Mezclar la suspensión con una pipeta de un mililitro e incubarla durante 90 segundos a temperatura ambiente. Agregue 10 mililitros de tampón BSA frío a la mezcla de reacción y centrífuga a 350 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en tampón de tinción y cuente las células con un hemocitómetro. Resuspend las células a una concentración de 5 millones de células por mililitro para la tinción superficial. Transfiera 1 millón de células en 200 microlitros por pozo a una placa de 96 pocillos y centrífuga la placa a 350 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados.
Prepare una solución de bloque de citometría de flujo diluyendo el anticuerpo anti-1632 en tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de bloque de citometría de flujo. Incubar la suspensión durante 15 a 20 minutos a cuatro grados centígrados o en hielo.
Luego, agregue 150 microlitros de tampón de tinción a la placa y centrífuga 350 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Prepare la solución de anticuerpos de superficie diluyendo los anticuerpos de superficie en tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de anticuerpos de superficie e incubar la placa a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
Luego, lave las células dos veces con tampón de tinción. Prepare el tampón de fijación y permeabilización mezclando tres partes de diluyente de fijación y permeabilización y una parte de tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros del tampón prepreparado por pozo de la placa de 96 pocillos e incube durante 20 a 25 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
Diluya el tampón de permeabilización con agua desionizada purificada para preparar una vez el tampón de permeabilización y úselo para lavar las células. Prepare una solución de anticuerpos intracelulares diluyendo con un mililitro de tampón de permeabilización. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de anticuerpos intracelulares diluidos por pocillo de la placa de 96 pocillos e incubar durante 40 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
Lave las células con tampón de permeabilización, luego con tampón de tinción. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de tinción. Adquirir un mínimo de 1,5 millones de células por muestra en el citómetro de flujo.
Después de una cirugía exitosa y un procedimiento postoperatorio apropiado, los desechos y los dobletes se excluyeron a través de una estrategia de cierre. Las células inmunes se identificaron utilizando el marcador hematopoyético CD45+ a través de citometría de flujo. Las células se distinguían como vivas o muertas.
Las células pulmonares inmunes se clasificaron en tres grupos utilizando anticuerpos anti-GR-1 y anti-CD68. Los neutrófilos fueron identificados y verificados usando Ly6G como un marcador único. La población CD45 + también contiene células asesinas naturales, células T y células B.
Estas células fueron teñidas y verificadas por anticuerpos asesinos naturales 1.1, CD3 y B220. El lavado broncoalveolar identificó eosinófilos que fueron positivos para el marcador CD11b, y macrófagos alveolares que no expresaron altos niveles de CD11b. Se encontraron células dendríticas CD45 + y se confirmaron mediante la expresión de CD24.
Estas células mostraron una respuesta positiva o negativa hacia los marcadores CD103 y CD11b. Las células CD103 negativas se clasificaron como células dendríticas convencionales y derivadas de monocitos en función de la expresión de CD64. las células dendríticas derivadas de monocitos fueron bajas positivas para el marcador dendrítico CD24 y positivas para el marcador panmacrófago CD64.
Los macrófagos intersticiales con monocitos clásicos y no clásicos se distinguieron en función de la expresión de CD64 y GR-1. Estas células mostraron una expresión positiva para el receptor de quimiocina CX3C uno. Los pasos más importantes en este procedimiento son la recolección adecuada de tejidos, la digestión y la preparación de la suspensión unicelular, y la apertura de células vivas y singletes.
Además de caracterizar las células inmunes del pulmón mediante citometría de flujo, se pueden realizar cultivos celulares y ensayos funcionales en poblaciones celulares aisladas. Esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores exploren nuevas preguntas en enfermedades del pulmón, como infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer.
