肺は非常に複雑でユニークな免疫系を宿主としているため、肺免疫細胞を同定するためのいくつかのゲーティング戦略が開発され、報告されている。いくつかの異なるアプローチが存在するため、異なるラボで生成された結果を比較することは困難です。当社のゲーティング戦略は、9つのマーカーを使用して最大12種類の肺ミエロイド系および非骨髄系免疫集団を同定するための包括的で再現可能な方法を提供します。
本プロトコールは、定常状態下における肺免疫集団の特性評価および同定を記載する。しかし、このプロトコルは、様々な疾患モデルにおけるこれらの細胞集団の変化を同定するために用いることができ、そこでは、肺免疫ランドスケープの疾患特異的変化を同定するのに役立つ可能性がある。この技術を初めて行う研究者は、肺組織からの免疫細胞の放出に大きな違いをもたらすため、消化条件および試薬に注意を払うべきである。
安楽死させた動物を手術のために準備することから始めます。4つの四肢に針またはテープを使用してマウスの背側を安定させ、70%エタノールを使用して腹側の皮膚を消毒する。首から腹部まで切開します。
胸部領域から皮膚を取り除き、肋骨および胸骨とともに除去する。18~21ゲージの針で右心室に10ミリリットルの冷たいPBSを注入し、完全に白くなるまで肺を洗い流します。その後、肺に触れることなく胸腺と心臓を取り除きます。
肺を周囲の組織から切り離し、冷たいBSA緩衝液を含むチューブに移す。肺をペトリ皿に移し、2つの細かいメスを使ってそれを細かく刻み、そしてそれを50ミリリットルの円錐形の管に入れる。5ミリリットルの消化バッファーを加えてプレートを洗浄する。
チューブの蓋を固定し、眼窩シェーカーで37°Cで毎分150回転の速度で肺を30分間消化する。10ミリリットルの冷BSA緩衝液を加えて反応を停止する。消化後、18ゲージの針を使用して肺片を混合して溶解する。
新しい50ミリリットルの円錐形チューブの上に70マイクロメートルのフィルターストレーナーを置き、消化された肺混合物をストレーナーに移します。10ミリリットルのシリンジプランジャーのゴム側を使用して、フィルター上の残りの肺片を粉砕し、BSAバッファーで洗浄します。単一細胞懸濁液を350Gで摂氏7度で8分間遠心分離する。
上清を捨て、細胞を1ミリリットルのACK溶解バッファーに再懸濁する。懸濁液を1ミリリットルのピペットを用いて混合し、室温で90秒間インキュベートする。反応混合物に10ミリリットルの冷BSA緩衝液を加え、350Gで摂氏4度で7分間遠心分離する。
上清を捨て、ペレットを染色バッファーに再懸濁し、血球計数器を用いて細胞を計数した。表面染色のために、1ミリリットルあたり500万個の細胞の濃度で細胞を再懸濁する。1ウェルあたり200マイクロリットルの100万個の細胞を96ウェルプレートに移し、プレートを350Gで摂氏4度で7分間遠心分離する。
抗1632抗体を染色バッファーで希釈してフローサイトメトリーブロック溶液を調製する。細胞を50マイクロリットルのフローサイトメトリーブロック溶液に再懸濁する。懸濁液を摂氏4度または氷上で15〜20分間インキュベートする。
次いで、150マイクロリットルの染色緩衝液をプレートに加え、それを350Gで摂氏4度で5分間遠心分離する。表面抗体を染色バッファーで希釈して表面抗体溶液を調製する。細胞を50マイクロリットルの表面抗体溶液に再懸濁し、暗所でプレートを摂氏4度でインキュベートした。
その後、染色バッファーで細胞を2回洗浄する。3部固定・透過処理希釈液と1部染色バッファーを混合して固定・透過流化バッファーを調製する。96ウェルプレートのウェルあたり50マイクロリットルの予め調製された緩衝液に細胞を再懸濁し、暗所で摂氏4度で20〜25分間インキュベートする。
透過処理バッファーを精製脱イオン水で希釈して透過バッファーを1回調製し、それを使用して細胞を洗浄します。1ミリリットルの透過処理バッファーで希釈して細胞内抗体溶液を調製する。96ウェルプレートのウェルあたり50マイクロリットルの希釈した細胞内抗体溶液に細胞を再懸濁し、暗所で摂氏4度で40分間インキュベートした。
細胞を透過処理バッファーで洗浄し、次いで染色バッファーで洗浄します。最終洗浄後、細胞を200マイクロリットルの染色緩衝液に再懸濁する。フローサイトメーターでサンプルあたり最低 150 万個の細胞を取得します。
手術が成功し、術後適切な処置が行われた後、破片およびダブレットはゲーティング戦略によって排除された。免疫細胞は、フローサイトメトリーを介してCD45+造血マーカーを用いて同定された。細胞は生きているか死んでいるかと区別された。
免疫肺細胞を、抗GR-1抗体および抗CD68抗体を用いて3つの群に分類した。好中球は、ユニークなマーカーとしてLy6Gを用いて同定および検証された。CD45+集団には、ナチュラルキラー細胞、T細胞、およびB細胞も含まれています。
これらの細胞を染色し、ナチュラルキラー1.1、CD3、およびB220抗体によって検証した。気管支肺胞洗浄により、CD11bマーカーに陽性の好酸球と、高レベルのCD11bを発現しない肺胞マクロファージが同定された。
これらの細胞は、CD103およびCD11bマーカーに対して陽性または陰性応答のいずれかを示した。CD103陰性細胞は、CD64発現に基づいて従来および単球由来樹状細胞として分類した。単球由来樹状細胞はCD24樹状細胞に対して低陽性であり、CD64汎マクロファージマーカーに対して陽性であった。
古典的および非古典的単球を有する間質性マクロファージは、CD64およびGR−1発現に基づいて区別された。これらの細胞はCX3Cケモカイン受容体1に対して陽性発現を示した。この手順における最も重要なステップは、適切な組織採取、消化、および単一細胞懸濁液の調製、ならびに生細胞および単一細胞上のゲーティングである。
フローサイトメトリーによって肺の免疫細胞を特徴付けることに加えて、細胞培養および機能アッセイを単離された細胞集団において行うことができる。この技術は、研究者が感染症、自己免疫疾患、癌などの肺疾患における新しい疑問を探求するための道を開くことができます。
