نظرا لأن الرئة تستضيف نظاما مناعيا معقدا وفريدا للغاية ، فقد تم تطوير العديد من استراتيجيات البوابة لتحديد الخلايا المناعية الرئوية والإبلاغ عنها. إن وجود العديد من الأساليب المختلفة يجعل من الصعب مقارنة النتائج الناتجة عن المختبرات المختلفة. توفر استراتيجيتنا للبوابات طريقة شاملة وقابلة للتكرار لتحديد ما يصل إلى 12 مجموعة مناعية مختلفة من النخاع الرئوي وغير النخاعي باستخدام تسع علامات.
يصف هذا البروتوكول توصيف وتحديد مجموعات المناعة الرئوية في ظل ظروف الحالة الثابتة. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد التغيرات في مجموعات الخلايا هذه في نماذج الأمراض المختلفة ، حيث يمكن أن يساعد في تحديد التغيرات الخاصة بالمرض في المشهد المناعي للرئة. يجب على الباحثين الذين يقومون بهذه التقنية لأول مرة الانتباه إلى ظروف الهضم والكواشف ، لأنها تحدث فرقا كبيرا في إطلاق الخلايا المناعية من أنسجة الرئة.
ابدأ بإعداد الحيوان الرحيم للجراحة. قم بتثبيت الماوس ظهريا باستخدام إبر أو شريط لاصق على الأطراف الأربعة ، ثم استخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم جلد المنطقة البطنية. قم بعمل شق من الرقبة إلى البطن.
إزالة الجلد من منطقة الصدر ، جنبا إلى جنب مع الأضلاع والقص. اغسل الرئتين عن طريق حقن 10 ملليلتر من PBS البارد في البطين الأيمن باستخدام إبرة قياس 18 إلى 21 حتى تصبح بيضاء تماما. ثم قم بإزالة الغدة الصعترية والقلب دون لمس الرئتين.
افصل الرئتين عن الأنسجة المحيطة وانقلها إلى أنبوب يحتوي على مخزن مؤقت BSA بارد. انقل الرئة إلى طبق بتري ، وفرمه باستخدام مشرطين ناعمين ، ثم ضعه في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. أضف خمسة ملليلترات من مخزن الهضم العازل لغسل اللوحة.
قم بتأمين غطاء الأنبوب وهضم الرئة لمدة 30 دقيقة على شاكر مداري بسرعة 150 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. أوقف التفاعل بإضافة 10 ملليلتر من المخزن المؤقت BSA البارد. بعد الهضم ، اخلط قطع الرئة وقم بإذابتها باستخدام إبرة قياس 18.
ضع مصفاة مرشح بسعة 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر وانقل خليط الرئة المهضوم إلى المصفاة. استخدم الجانب المطاطي من مكبس حقنة سعة 10 ملليلتر لتحطيم قطع الرئة المتبقية على الفلتر وغسلها باستخدام مخزن BSA المؤقت. الطرد المركزي للتعليق أحادي الخلية عند 350 G لمدة ثماني دقائق عند سبع درجات مئوية.
تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل ACK. امزج التعليق باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد واحتضنها لمدة 90 ثانية في درجة حرارة الغرفة. أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت BSA البارد إلى خليط التفاعل وقم بطرده مركزيا عند 350 جم لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية.
تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في مخزن تلطيخ مؤقت ، وقم بحساب الخلايا باستخدام مقياس مفائض الدم. أعد تعليق الخلايا بتركيز 5 ملايين خلية لكل ملليلتر لتلطيخ السطح. انقل مليون خلية في 200 ميكرولتر لكل بئر إلى صفيحة من 96 بئرا وقم بالطرد المركزي للصفيحة عند 350 جم لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية.
قم بإعداد محلول كتلة قياس التدفق الخلوي عن طريق تخفيف الأجسام المضادة المضادة ل 1632 في المخزن المؤقت للتلطيخ. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول كتلة قياس التدفق الخلوي. احتضن التعليق لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية أو على الجليد.
ثم ، أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ إلى اللوحة وقم بطردها مركزيا 350 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تحضير محلول الأجسام المضادة السطحية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة السطحية في المخزن المؤقت للتلطيخ. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة السطحية واحتضن الصفيحة عند أربع درجات مئوية في الظلام.
ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن مؤقت للتلطيخ. قم بإعداد المخزن المؤقت للتثبيت والتخلل عن طريق خلط ثلاثة أجزاء من التثبيت ومخفف التخلل وجزء واحد من المخزن المؤقت للتلطيخ. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعد مسبقا لكل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا واحتضنها لمدة 20 إلى 25 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام.
قم بتخفيف المخزن المؤقت للنفاذية بالماء النقي منزوع الأيونات لإعداد مخزن مؤقت للتخلل مرة واحدة واستخدامه لغسل الخلايا. تحضير محلول الأجسام المضادة داخل الخلايا عن طريق التخفيف مع ملليلتر واحد من المخزن المؤقت permeabilization. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة داخل الخلايا المخفف لكل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا واحتضنها لمدة 40 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام.
اغسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت للنفاذية ، ثم باستخدام المخزن المؤقت للتلطيخ. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. الحصول على ما لا يقل عن 1.5 مليون خلية لكل عينة على مقياس التدفق الخلوي.
بعد إجراء عملية جراحية ناجحة وإجراء مناسب بعد العملية الجراحية ، تم استبعاد الحطام والمزدوجات من خلال استراتيجية البوابة. تم تحديد الخلايا المناعية باستخدام علامة CD45 + المكونة للدم عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم تمييز الخلايا على أنها حية أو ميتة.
تم تصنيف خلايا الرئة المناعية إلى ثلاث مجموعات باستخدام الأجسام المضادة المضادة GR-1 و CD68 المضادة. تم تحديد العدلات والتحقق منها باستخدام Ly6G كعلامة فريدة. يحتوي CD45 + السكان أيضا على خلايا قاتلة طبيعية وخلايا تائية وخلايا بائية.
تم تلطيخ هذه الخلايا والتحقق منها بواسطة الأجسام المضادة القاتلة الطبيعية 1.1 و CD3 و B220. حدد غسل القصبات السنخية الحمضات التي كانت إيجابية لعلامة CD11b ، والبلاعم السنخية التي لم تعبر عن مستويات عالية من CD11b. تم العثور على خلايا CD45 + المتغصنة وتأكيدها بواسطة تعبير CD24.
أظهرت هذه الخلايا إما استجابة إيجابية أو سلبية تجاه علامات CD103 و CD11b. تم تصنيف الخلايا السالبة CD103 على أنها خلايا تغصنية تقليدية ومشتقة من الخلايا الأحادية بناء على تعبير CD64. كانت الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية إيجابية منخفضة لعلامة تغصن CD24 ، وإيجابية لعلامة البلاعم CD64.
تم تمييز البلاعم الخلالية مع الخلايا الوحيدة الكلاسيكية وغير الكلاسيكية على أساس تعبير CD64 و GR-1. أظهرت هذه الخلايا تعبيرا إيجابيا لمستقبلات الكيموكين CX3C الأولى. أهم الخطوات في هذا الإجراء هي حصاد الأنسجة السليم ، والهضم ، وإعداد تعليق الخلية الواحدة ، وبوابة على الخلايا الحية والمفردات.
بالإضافة إلى توصيف الخلايا المناعية للرئة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، يمكن إجراء زراعة الخلايا والاختبارات الوظيفية في مجموعات الخلايا المعزولة. يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين لاستكشاف أسئلة جديدة في أمراض الرئة ، مثل العدوى وأمراض المناعة الذاتية والسرطان.
