폐는 매우 복잡하고 독특한 면역 체계를 보유하기 때문에 폐 면역 세포의 확인을위한 몇 가지 게이팅 전략이 개발되고보고되었습니다. 여러 가지 접근법이 존재하기 때문에 다른 실험실에서 생성 된 결과를 비교하기가 어렵습니다. 우리의 게이팅 전략은 아홉 개의 마커를 사용하여 최대 12 개의 다른 폐 골수성 및 비 골수성 면역 집단을 식별 할 수있는 포괄적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다.
본 프로토콜은 정상 상태 조건 하에서 폐 면역 집단의 특성화 및 동정을 기술한다. 그러나, 이 프로토콜은 다양한 질병 모델에서 이들 세포 집단의 변화를 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 폐 면역 환경의 질병 특이적 변화를 확인하는 것을 도울 수 있다. 이 기술을 처음으로 수행하는 연구자는 폐 조직에서 면역 세포의 방출에 큰 차이를 만들기 때문에 소화 조건과 시약에주의를 기울여야합니다.
수술을 위해 안락사 된 동물을 준비하는 것으로 시작하십시오. 네 사지에 바늘이나 테이프를 사용하여 마우스를 등쪽으로 안정화 한 다음 70 % 에탄올을 사용하여 복부 부위의 피부를 소독하십시오. 목에서 복부까지 절개하십시오.
갈비뼈와 흉골과 함께 흉부 부위에서 피부를 제거하십시오. 완전히 흰색이 될 때까지 18 ~ 21 게이지 바늘을 사용하여 10 밀리리터의 차가운 PBS를 우심실에 주입하여 폐를 플러시하십시오. 그런 다음 폐를 만지지 않고 흉선과 심장을 제거하십시오.
폐를 주변 조직에서 분리하여 차가운 BSA 버퍼가 들어있는 튜브로 옮깁니다. 폐를 페트리 접시로 옮기고 두 개의 미세한 메스를 사용하여 다진 다음 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣으십시오. 다섯 밀리리터의 소화 완충액을 넣어 접시를 씻으십시오.
튜브의 뚜껑을 고정하고 섭씨 37도에서 분당 150 회전의 속도로 궤도 쉐이커에서 30 분 동안 폐를 소화하십시오. 차가운 BSA 버퍼 10 밀리리터를 첨가하여 반응을 중지하십시오. 소화 후, 18 게이지 바늘을 사용하여 폐 조각을 혼합하고 용해시킨다.
새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브 위에 70 마이크로 미터 필터 스트레이너를 놓고 소화 된 폐 혼합물을 스트레이너로 옮깁니다. 10밀리리터 주사기 플런저의 고무 면을 사용하여 필터의 나머지 폐 조각을 부수고 BSA 버퍼로 세척합니다. 단일 세포 현탁액을 섭씨 7도에서 8분 동안 350 G에서 원심분리한다.
상청액을 버리고 세포를 ACK 용해 완충액 한 밀리리터에 재현탁시킨다. 현탁액을 일밀리리터 피펫을 사용하여 혼합하고 실온에서 90초 동안 인큐베이션한다. 차가운 BSA 완충액 10 밀리리터를 반응 혼합물에 첨가하고, 섭씨 네 도에서 7분 동안 350 G에서 원심분리한다.
상청액을 버리고, 펠렛을 염색 완충액에 재현탁시키고, 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수한다. 표면 염색을 위해 세포를 밀리리터 당 5 백만 세포의 농도로 재현탁하십시오. 웰당 200마이크로리터의 1백만 세포를 96웰 플레이트로 옮기고 플레이트를 섭씨 4도에서 7분 동안 350G에서 원심분리한다.
항-1632 항체를 염색 완충액에 희석하여 유세포 분석 블록 용액을 제조하였다. 세포를 50 마이크로리터의 유세포 분석 블록 용액에 재현탁시킨다. 현탁액을 섭씨 또는 얼음 위에서 네 도에서 15 ~ 20 분 동안 배양하십시오.
이어서, 150 마이크로리터의 염색 완충액을 플레이트에 첨가하고, 이를 섭씨 네 도에서 5분 동안 350 G로 원심분리한다. 표면 항체를 염색 완충액에 희석하여 표면 항체 용액을 준비한다. 세포를 표면 항체 용액의 50 마이크로리터에 재현탁시키고, 플레이트를 어둠 속에서 섭씨 네 도에서 인큐베이션한다.
그런 다음 염색 버퍼로 세포를 두 번 씻으십시오. 고정화 및 투과화 완충액을 세 부 고정과 투과 희석제와 한 부 염색 완충액을 혼합하여 준비한다. 세포를 96-웰 플레이트의 웰 당 미리 준비된 완충액 50 마이크로리터에 재현탁시키고, 어둠 속에서 섭씨 4도에서 20 내지 25분 동안 인큐베이션한다.
투과 완충액을 정제된 탈이온수로 희석하여 일회 투과 완충액을 제조하고 이를 이용하여 세포를 세척한다. 한 밀리리터의 투과 완충액으로 희석하여 세포내 항체 용액을 준비한다. 세포를 96-웰 플레이트의 웰 당 희석된 세포내 항체 용액 50 마이크로리터에 재현탁시키고, 어둠 속에서 섭씨 4도에서 40분 동안 인큐베이션한다.
투과 완충액으로 세포를 세척 한 다음 염색 완충액으로 씻으십시오. 최종 세척 후, 세포를 200 마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁시킨다. 유세포 분석기 상에서 샘플 당 최소 1.5백만 세포를 획득한다.
성공적인 수술과 적절한 수술 후 수술 후, 파편과 이중은 게이팅 전략을 통해 배제되었습니다. 면역 세포는 유세포 분석기를 통해 CD45+조혈 마커를 사용하여 확인되었다. 세포는 살아있는 또는 죽은 것으로 구별되었다.
면역 폐 세포를 항-GR-1 및 항-CD68 항체를 사용하여 세 그룹으로 분류하였다. 호중구는 독특한 마커로서 Ly6G를 사용하여 확인되고 검증되었다. CD45+ 집단은 또한 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포를 함유한다.
이들 세포를 염색하고 자연 살해 1.1, CD3, 및 B220 항체에 의해 검증하였다. 기관지 폐포 세척은 CD11b 마커에 대해 양성인 호산구와 높은 수준의 CD11b를 발현하지 않는 폐포 대식세포를 확인했다. CD45+수지상 세포는 CD24 발현에 의해 발견되고 확인되었다.
이들 세포는 CD103 및 CD11b 마커에 대해 양성 또는 음성 반응을 보였다. CD103 음성 세포는 CD64 발현에 기초하여 통상적인 단핵구 유래 수지상 세포로 분류되었다. 단핵구 유래 수지상 세포는 CD24 수지상 마커에 대해 낮은 양성이었고, CD64 범 대식세포 마커에 대해 양성이었다.
고전적 및 비고전적 단핵구를 갖는 간질성 대식세포는 CD64 및 GR-1 발현에 기초하여 구별되었다. 이들 세포는 CX3C 케모카인 수용체에 대해 양성 발현을 나타냈다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 적절한 조직 수확, 소화 및 단일 세포 현탁액의 준비, 살아있는 세포 및 일중항 위의 게이팅입니다.
유세포 분석기에 의해 폐의 면역 세포를 특성화하는 것 외에도, 세포 배양 및 기능적 분석은 단리된 세포 집단에서 수행될 수 있다. 이 기술은 연구자가 감염,자가 면역 질환 및 암과 같은 폐 질환에 대한 새로운 질문을 탐구 할 수있는 길을 열어 줄 수 있습니다.
