Este método se puede utilizar para ayudar a los investigadores a analizar y contar los cocultivos de células utilizando un análisis simple y efectivo basado en el área. Esta técnica es relativamente fácil de implementar utilizando un software ampliamente disponible y ofrece un medio confiable y preciso para identificar varios tipos de células dentro de un entorno de cocultivo. Este método puede proporcionar información sobre cómo los cocultivos específicos de células se sinergizan para ayudar en la regeneración de tejidos.
Este método también se puede emplear para validar los estudios de biomarcadores de monocultivo. Para comenzar, cultive 264.7 macrófagos crudos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para imágenes de monocultivo en un mililitro de DMEM suplementados con FBS, penicilina-estreptomicina, bicarbonato de sodio y beta-mercaptoetanol en un matraz de cultivo celular de cinco mililitros a una densidad de 25,000 células por centímetro cuadrado. Cultivo de células NIH/3T3 en DMEM suplementado con 10% FBS y 1%penicilina-estreptomicina.
Para las imágenes de cocultivo, cultive macrófagos crudos 264.7 y fibroblastos NIH/3T3 utilizando medio de cocultivo que contenga una parte cruda de medio 264.7 y una parte de medio NIH/3T3 juntas en proporciones variadas y densidad total de 25,000 células por centímetro cuadrado. Después de la siembra, incubar las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para alcanzar una densidad celular viable de 80% de confluencia celular. Para adquirir imágenes celulares utilizando un microscopio invertido equipado con el objetivo 40X, determine la capacidad del algoritmo para evaluar con precisión imágenes con una gama de cualidades de imagen.
Adquiera imágenes en escala de grises con diferentes focos que produzcan imágenes no bulbus y bulbus y expórtelas en el archivo czi sin procesar. Para obtener imágenes de celdas utilizando el método basado en áreas, copie y pegue el archivo de imagen para su análisis en la papelera e introduzca el nombre de archivo ejecutando el comando. Presione Ejecutar para iniciar el programa.
Analice las imágenes abriendo por reconstrucción, seguido de cerrando por reconstrucción utilizando funciones de origen para ampliar el primer plano desde el fondo ejecutando el comando respectivo. Para binarizar las imágenes reconstruidas utilizando un sistema de identificación basado en percentiles, distinga las celdas del fondo utilizando una diferencia de percentil del píxel máximo relevante con el valor de píxel más grande que comprende al menos el 0,5% de una imagen dada. Analice y evalúe los valores de píxeles para macrófagos 264.7 sin procesar, asegurándose de que los valores estén dentro del 4.5% del píxel máximo relevante.
A continuación, marque el píxel como celular. Para las imágenes que contienen perfiles de células bulbosas, implemente un procedimiento iterativo para corregir la binarización errónea en los centros de las células. Determine una suposición inicial para la cobertura total de la celda.
Ejecute el algoritmo y analice las imágenes utilizando estimaciones iniciales de alfa y kappa para llenar una parte de las islas. Luego use los recuentos de células posteriores al análisis y la cobertura para recalcular kappa. Para determinar el área celular promedio después de la binarización de la imagen, obtenga un vector de todas las ubicaciones centrales y radios de círculos que se encuentran dentro de la imagen ejecutando el comando.
Utilice las salidas de radios para calcular el área celular promedio promediando y analizando al menos 10 celdas para garantizar una identificación precisa del área. Realice el análisis de imágenes utilizando los comandos descritos anteriormente. Luego, realice un análisis de cocultivos que contengan células crudas 264.7 y NIH / 3T3 determinando experimentalmente un parámetro phi utilizando imágenes de células crudas 264.7 y NIH / 3T3.
Adivine un valor phi inicial e itere hasta que los recuentos celulares y la cobertura coincidan estrechamente con los recuentos manuales específicos del cocultivo 264.7 y NIH/3T3 en bruto. Determine los recuentos de células 264.7 en bruto en la cobertura celular total como se describió anteriormente para las imágenes de monocultivo. Analizar de nuevo la imagen transformada de la cuenca hidrográfica sin el parámetro phi, detectando tanto macrófagos como fibroblastos.
Adquiera datos de fibroblastos NIH/3T3 restando selectivamente 264,7 píxeles celulares brutos obtenidos utilizando los métodos estándar de umbral y cuantificación basados en área descritos anteriormente. Se realizó un análisis de macrófagos crudos no bulbosos de 264,7 y se registraron las salidas del algoritmo. Los cálculos de área promedio de la imagen utilizando el algoritmo contaron 226 células, mientras que un recuento manual identificó 241 células con un valor de error aproximado del 6%También se realizó un análisis de bulbus raw de 264,7 macrófagos.
Los cálculos de área promedio de la imagen utilizando el algoritmo contaron 221 células, verificadas por un recuento manual de 252 células con un valor de error aproximado del 12%Se realizó un análisis de cocultivos que contenían macrófagos 264.7 crudos y fibroblastos NIH/3T3. Las salidas del algoritmo para el recuento de macrófagos 264.7 en bruto fueron 137, mientras que un recuento manual identificó 155 células con un valor de error aproximado del 11% Para determinar la robustez del algoritmo de recuento de células, se contaron cinco imágenes de macrófagos 264.7 en bruto mediante identificación automática de células y recuentos manuales de usuarios. El coeficiente de dados se obtuvo con un parámetro promedio de 0,85 en cinco imágenes.
El paso crítico dentro de este protocolo es el uso de parámetros basados en percentiles que permiten una detección celular robusta tanto en imágenes de monocultivo como de cocultivo. Este protocolo se puede utilizar para identificar células de interés para su posterior análisis utilizando técnicas de biología molecular para evaluar biomarcadores que definen poblaciones celulares específicas y el desarrollo de biomarcadores en sistemas de cocultivo.
