Этот метод может быть использован, чтобы помочь исследователям анализировать и подсчитывать кокультуры клеток с использованием простого и эффективного зонального анализа. Этот метод относительно прост в реализации с использованием широко доступного программного обеспечения и предлагает надежные и точные средства идентификации различных типов клеток в условиях кокультуры. Этот метод может дать представление о том, как специфические кокультуры клеток синергизируются, чтобы помочь в регенерации тканей.
Этот метод также может быть использован для проверки исследований биомаркеров монокультуры. Для начала культивируйте необработанные 264,7 макрофаги при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа для монокультурной визуализации в одном миллилитре DMEM, дополненном FBS, пенициллин-стрептомицином, бикарбонатом натрия и бета-меркаптоэтанолом в пятимиллилитровой колбе клеточной культуры с плотностью 25 000 клеток на квадратный сантиметр. Культивирование клеток NIH/3T3 в DMEM дополнено 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином.
Для кокультурной визуализации культивируют необработанные макрофаги 264,7 и фибробласты NIH/3T3 с использованием кокультурной среды, содержащей одну часть сырой среды 264,7 и одну часть среды NIH/3T3 вместе при различных соотношениях и общей плотности 25 000 клеток на квадратный сантиметр. После посева инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы достичь жизнеспособной плотности клеток 80% слияния клеток. Чтобы получить изображения клеток с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного объективом 40X, определите способность алгоритма точно оценивать изображения с диапазоном качеств изображения.
Получайте изображения в оттенках серого с различными фокусами, производя как нелюльбусные, так и бульбусные изображения, и экспортируйте их в необработанный файл czi. Чтобы получить изображения ячеек с помощью метода area-based, скопируйте и вставьте файл изображения для анализа в корзину и введите имя файла, выполнив команду. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы запустить программу.
Проанализируйте изображения путем открытия путем реконструкции, а затем закрытия путем реконструкции с использованием исходных функций для увеличения переднего плана от фона, выполнив соответствующую команду. Чтобы бинаризировать реконструированные изображения с использованием системы идентификации на основе процентилей, отличьте ячейки от фона, используя процентильную разницу от максимального релевантного пикселя с наибольшим значением пикселя, составляющим не менее 0,5% данного изображения. Анализируйте и оценивайте значения пикселей для необработанных макрофагов 264,7, гарантируя, что значения находятся в пределах 4,5% от максимального релевантного пикселя.
Затем пометьте пиксель как сотовый. Для изображений, содержащих профили клеток bulbus, реализуйте итеративную процедуру для исправления ошибочной бинаризации в центрах клеток. Определите первоначальное предположение для общего покрытия сотовой связи.
Запустите алгоритм и проанализируйте изображения, используя первоначальные оценки альфа и каппы, чтобы заполнить часть островов. Затем используйте количество клеток и покрытие после анализа для пересчета каппы. Чтобы определить среднюю площадь ячейки после бинаризации изображения, получите вектор всех центральных расположений и радиусов окружностей, найденных внутри изображения, выполнив команду.
Используйте выходы радиусов для расчета средней площади ячейки путем усреднения и анализа не менее 10 ячеек для обеспечения точной идентификации области. Выполните анализ изображения с помощью команд, как описано выше. Затем проводят анализ кокультур, содержащих необработанные 264,7 и NIH/3T3 клетки, экспериментально определяя параметр phi с использованием изображений необработанных клеток 264.7 и NIH/3T3.
Угадайте начальное значение phi и итерируйте до тех пор, пока количество ячеек и покрытие не совпадут с ручными подсчетами, специфичными для необработанной кокультуры 264.7 и NIH/3T3. Определите количество необработанных клеток 264,7 в общем покрытии клеток, как описано ранее для изображений монокультуры. Снова проанализируйте преобразованное изображение водораздела без параметра phi, обнаружив как макрофаги, так и фибробласты.
Получение данных фибробластов NIH/3T3 путем выборочного вычитания необработанных 264,7 клеточных пикселей, полученных с использованием стандартных методов порогового значения и количественной оценки на основе площади, описанных ранее. Проведен анализ нелульбусных сырых 264,7 макрофагов и записаны алгоритмические выходы. Расчет средней площади изображения с помощью алгоритма насчитал 226 клеток, в то время как ручной подсчет выявил 241 ячейку с приблизительным значением погрешности 6% Также был проведен анализ бульбуса необработанных 264,7 макрофагов.
При расчете средней площади изображения с помощью алгоритма насчитали 221 клетку, проверенную ручным подсчетом 252 клеток с приблизительным значением погрешности 12% Проведен анализ кокультур, содержащих как необработанные макрофаги 264,7, так и фибробласты NIH/3T3. Выходы алгоритма для необработанного количества макрофагов 264,7 составили 137, в то время как ручной подсчет выявил 155 клеток с приблизительным значением ошибки 11% Чтобы определить надежность алгоритма подсчета клеток, пять необработанных изображений макрофагов 264,7 были подсчитаны с помощью автоматической идентификации клеток и ручного подсчета пользователей. Коэффициент Dice был получен со средним параметром 0,85 на пяти изображениях.
Критическим шагом в этом протоколе является использование параметров на основе процентилей, которые позволяют надежно обнаруживать клетки как в монокультурных, так и в кокультурных изображениях. Этот протокол может быть использован для идентификации клеток, представляющих интерес для дальнейшего анализа с использованием методов молекулярной биологии для оценки биомаркеров, которые определяют конкретные клеточные популяции и развитие биомаркеров в системах кокультур.
