Bu yöntem, araştırmacıların basit ve etkili bir alan tabanlı analiz kullanarak hücrelerin ortak kültürlerini analiz etmelerine ve saymalarına yardımcı olmak için kullanılabilir. Bu tekniğin yaygın olarak bulunan yazılımı kullanarak uygulanması nispeten kolaydır ve bir ortak kültür ortamında çeşitli hücre tiplerini tanımlamak için güvenilir ve doğru bir araç sunar. Bu yöntem, hücrelerin spesifik ko-kültürlerinin doku yenilenmesine yardımcı olmak için nasıl sinerji oluşturduğuna dair fikir verebilir.
Bu yöntem, monokültür biyobelirteç çalışmalarını doğrulamak için de kullanılabilir. Başlamak için, kültür, 37 santigrat derecede 264.7 makrofajlar ve bir mililitre DMEM'de monokültür görüntüleme için% 5 karbondioksit, FBS, penisilin-streptomisin, sodyum bikarbonat ve beta-merkaptoetanol ile desteklenmiş, santimetre kare başına 25.000 hücre yoğunluğu yoğunluğunda beş mililitrelik bir hücre kültürü şişesinde ham 264.7 makrofaj. DMEM'deki kültür NIH / 3T3 hücreleri% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir.
Ko-kültür görüntüleme için, kültür ham 264.7 makrofajlar ve NIH / 3T3 fibroblastları, çeşitli oranlarda ve santimetre kare başına toplam 25.000 hücre yoğunluğu ile birlikte bir parça ham 264.7 orta ve bir parça NIH / 3T3 ortamı içeren ko-kültür ortamı kullanarak. Tohumlamayı takiben,% 80 hücre birleşiminin canlı bir hücre yoğunluğuna ulaşmak için hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 40X hedefiyle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücre görüntüleri elde etmek için, algoritmanın bir dizi görüntü kalitesine sahip görüntüleri doğru bir şekilde değerlendirme kapasitesini belirleyin.
Hem bulbus olmayan hem de bulbus görüntüleri üreten farklı odaklara sahip gri tonlamalı görüntüler elde edin ve bunları ham czi dosyasına aktarın. Alan tabanlı yöntemi kullanarak hücrelerin görüntülerini elde etmek için, çözümleme için görüntü dosyasını kopyalayıp çöp kutusuna yapıştırın ve komutu yürüterek dosya adını girin. Programı başlatmak için Çalıştır'a basın.
İlgili komutu yürüterek ön planı arka plandan büyütmek için kaynak işlevlerini kullanarak yeniden yapılandırarak görüntüleri yeniden yapılandırarak ve ardından yeniden yapılandırarak görüntüleri analiz edin. Yüzdelik dilim tabanlı bir tanımlama sistemi kullanarak yeniden yapılandırılmış görüntüleri ikilileştirmek için, belirli bir görüntünün en az %0,5'ini oluşturan en büyük piksel değerine sahip maksimum ilgili pikselden yüzdelik bir fark kullanarak hücreleri arka plandan ayırt edin. Ham 264,7 makrofajlar için piksel değerlerini analiz edip değerlendirerek değerlerin ilgili maksimum pikselin %4,5'i içinde olmasını sağlayın.
Ardından pikseli hücresel olarak işaretleyin. Bulbus hücre profilleri içeren görüntüler için, hücrelerin merkezlerindeki hatalı ikili yapılaşmayı düzeltmek için yinelemeli bir yordam uygulayın. Toplam hücre kapsamı için bir başlangıç tahmini belirleyin.
Algoritmayı çalıştırın ve adaların bir bölümünü doldurmak için alfa ve kappa'nın ilk tahminlerini kullanarak görüntüleri analiz edin. Ardından, kappa'yı yeniden hesaplamak için analiz sonrası hücre sayımlarını ve kapsamını kullanın. Görüntünün ikilendirilmesinden sonra ortalama hücre alanını belirlemek için, komutu yürüterek görüntü içinde bulunan tüm merkez konumlarının ve dairelerin yarıçaplarının bir vektörünü elde edin.
Ortalama hücre alanını ortalamayla hesaplamak için yarıçap çıkışlarını kullanın ve doğru alan tanımlamasını sağlamak için en az 10 hücreyi analiz edin. Daha önce açıklandığı gibi komutları kullanarak görüntü analizini gerçekleştirin. Ardından, ham 264.7 ve NIH / 3T3 hücrelerinin görüntülerini kullanarak deneysel olarak bir parametre phi belirleyerek ham 264.7 ve NIH / 3T3 hücrelerini içeren ortak kültürlerin bir analizini yapın.
İlk phi değerini tahmin edin ve hücre sayıları ve kapsama alanı, ham 264.7 ve NIH / 3T3 ortak kültürüne özgü manuel sayımlarla yakından eşleşene kadar yineleyin. Monokültür görüntüleri için daha önce açıklandığı gibi toplam hücre kapsama alanındaki ham 264,7 hücre sayılarını belirleyin. Havza dönüştürülmüş görüntüyü phi parametresi olmadan tekrar analiz edin, hem makrofajları hem de fibroblastları tespit edin.
Daha önce açıklanan standart eşik ve alan tabanlı niceleme yöntemleri kullanılarak elde edilen ham 264,7 hücre piksellerini seçici olarak çıkararak NIH / 3T3 fibroblast verilerini elde edin. Bulbus dışı ham 264.7 makrofajların analizi yapılmış ve algoritma çıktıları kaydedilmiştir. Algoritma kullanılarak görüntünün ortalama alan hesaplamalarında 226 hücre sayılırken, manuel sayımda yaklaşık hata değeri %6 olan 241 hücre tespit edildi ve bulbus ham 264.7 makrofajın analizi de yapıldı.
Algoritma kullanılarak görüntünün ortalama alan hesaplamaları 221 hücreyi saydı, yaklaşık% 12'lik bir hata değerine sahip 252 hücrenin manuel sayımıyla doğrulandıHem ham 264.7 makrofajları hem de NIH / 3T3 fibroblastlarını içeren ko-kültürlerin analizi yapıldı. Ham 264.7 makrofaj sayısı için algoritma çıktıları 137 iken, manuel sayım yaklaşık% 11'lik bir hata değerine sahip 155 hücre tanımladıHücre sayma algoritmasının sağlamlığını belirlemek için, beş ham 264.7 makrofaj görüntüsü otomatik hücre tanımlama ve manuel kullanıcı sayımları ile sayıldı. Zar katsayısı, beş görüntüde ortalama 0,85 parametresiyle elde edildi.
Bu protokoldeki kritik adım, hem monokültür hem de ko-kültür görüntülerinde sağlam hücre tespitine izin veren yüzdelik dilim tabanlı parametrelerin kullanılmasıdır. Bu protokol, ko-kültür sistemlerinde spesifik hücre popülasyonlarını ve biyobelirteç gelişimini tanımlayan biyobelirteçleri değerlendirmek için moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak daha ileri analiz için ilgilenilen hücreleri tanımlamak için kullanılabilir.
