يمكن استخدام هذه الطريقة لمساعدة الباحثين على تحليل وإحصاء الثقافات المشتركة للخلايا باستخدام تحليل بسيط وفعال قائم على المنطقة. هذه التقنية سهلة التنفيذ نسبيا باستخدام البرامج المتاحة على نطاق واسع وتوفر وسيلة موثوقة ودقيقة لتحديد أنواع الخلايا المختلفة داخل بيئة الزراعة المشتركة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول كيفية تآزر الثقافات المشتركة المحددة للخلايا للمساعدة في تجديد الأنسجة.
يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للتحقق من صحة دراسات المؤشرات الحيوية أحادية الزراعة. للبدء ، استزراع 264.7 بلاعم خام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتصوير الزراعة الأحادية في ملليلتر واحد من DMEM مكملة ب FBS و penicillin-streptomycin و bicarbonate الصوديوم و beta-mercaptoethanol في قارورة زراعة خلايا سعة خمسة ملليلتر بكثافة 25،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. زراعة خلايا NIH / 3T3 في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين الستربتومايسين.
بالنسبة للتصوير بالزراعة المشتركة ، فإن زراعة البلاعم الخام 264.7 والخلايا الليفية NIH / 3T3 باستخدام وسط الاستزراع المشترك الذي يحتوي على جزء واحد خام 264.7 وسط وجزء واحد من NIH / 3T3 وسط معا بنسب مختلفة وكثافة إجمالية تبلغ 25،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. بعد البذر ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للوصول إلى كثافة خلية قابلة للحياة تبلغ 80٪ من التقاء الخلايا. للحصول على صور الخلايا باستخدام مجهر مقلوب مجهز بهدف 40X ، حدد قدرة الخوارزمية على تقييم الصور بدقة مع مجموعة من صفات الصورة.
احصل على صور بمقياس رمادي مع بؤر مختلفة تنتج صورا غير مصابة وبصلة وتصديرها في ملف czi الخام. للحصول على صور للخلايا باستخدام الطريقة المستندة إلى منطقة، انسخ ملف الصورة والصقه لتحليله في سلة المهملات وأدخل اسم الملف عن طريق تنفيذ الأمر. اضغط على تشغيل لبدء تشغيل البرنامج.
قم بتحليل الصور عن طريق الفتح عن طريق إعادة الإعمار ، يليه الإغلاق عن طريق إعادة الإعمار باستخدام وظائف المصدر لتكبير المقدمة من الخلفية عن طريق تنفيذ الأمر المعني. لربط الصور المعاد بناؤها باستخدام نظام تعريف قائم على النسبة المئوية ، قم بتمييز الخلايا عن الخلفية باستخدام فرق مئوي عن الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة مع أكبر قيمة بكسل تضم 0.5٪ على الأقل من صورة معينة. تحليل وتقييم قيم البكسل للبلاعم الخام 264.7 ، مما يضمن أن القيم في حدود 4.5٪ من الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة.
ثم ضع علامة على البيكسل كخلوي. بالنسبة للصور التي تحتوي على ملفات تعريف خلايا البصلصال ، قم بتنفيذ إجراء تكراري لتصحيح الثنائيات الخاطئة في مراكز الخلايا. حدد تخمينا أوليا لتغطية الخلية الإجمالية.
قم بتشغيل الخوارزمية وتحليل الصور باستخدام التقديرات الأولية لألفا وكابا لملء جزء من الجزر. ثم استخدم عدد الخلايا والتغطية بعد التحليل لإعادة حساب kappa. لتحديد متوسط مساحة الخلية بعد ثنائية الصورة، احصل على متجه لجميع مواقع المركز ونصف قطر الدوائر الموجودة داخل الصورة عن طريق تنفيذ الأمر.
استخدم مخرجات نصف القطر لحساب متوسط مساحة الخلية عن طريق حساب المتوسط وتحليل 10 خلايا على الأقل لضمان تحديد المنطقة بدقة. قم بإجراء تحليل الصورة باستخدام الأوامر كما هو موضح سابقا. ثم قم بإجراء تحليل للمزارع المشتركة التي تحتوي على خلايا 264.7 و NIH / 3T3 الخام عن طريق تحديد معلمة phi تجريبيا باستخدام صور لخلايا 264.7 الخام و NIH / 3T3.
خمن قيمة phi الأولية وكرر حتى يتطابق عدد الخلايا وتغطيتها بشكل وثيق مع الأعداد اليدوية الخاصة بالثقافة المشتركة الخام 264.7 و NIH / 3T3. حدد عدد الخلايا الخام 264.7 في إجمالي تغطية الخلايا كما هو موضح سابقا لصور الزراعة الأحادية. قم بتحليل الصورة المحولة إلى مستجمعات المياه مرة أخرى بدون معلمة phi ، واكتشاف كل من البلاعم والخلايا الليفية.
احصل على بيانات الخلايا الليفية NIH/3T3 عن طريق طرح 264.7 بكسل خلية خام تم الحصول عليها بشكل انتقائي باستخدام طرق العتبة القياسية والقياس الكمي القائم على المساحة الموضحة سابقا. تم إجراء تحليل للبلاعم الخام غير البصيلة 264.7 وتم تسجيل مخرجات الخوارزمية. أحصت حسابات متوسط مساحة الصورة باستخدام خوارزمية 226 خلية ، في حين حدد العد اليدوي 241 خلية بقيمة خطأ تقريبية تبلغ 6٪ تم أيضا إجراء تحليل للبلاعم الخام 264.7.
أحصت حسابات متوسط مساحة الصورة باستخدام خوارزمية 221 خلية ، تم التحقق منها من خلال إحصاء يدوي ل 252 خلية بقيمة خطأ تقريبية تبلغ 12٪ تم إجراء تحليل للمزارع المشتركة التي تحتوي على كل من البلاعم الخام 264.7 والخلايا الليفية NIH / 3T3. كانت مخرجات الخوارزمية لعدد البلاعم الخام 264.7 137 ، في حين حدد العد اليدوي 155 خلية بقيمة خطأ تقريبية تبلغ 11٪ لتحديد متانة خوارزمية عد الخلايا ، تم حساب خمس صور بلاعم 264.7 خام عن طريق التعرف التلقائي على الخلايا وعدد المستخدمين اليدوي. تم الحصول على معامل النرد بمتوسط معلمة 0.85 عبر خمس صور.
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي استخدام المعلمات القائمة على النسبة المئوية والتي تسمح بالكشف القوي عن الخلايا في كل من صور الزراعة الأحادية والصور ذات الزراعة المشتركة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخلايا ذات الأهمية لمزيد من التحليل باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية لتقييم المؤشرات الحيوية التي تحدد مجموعات خلايا معينة وتطوير المؤشرات الحيوية في أنظمة الزراعة المشتركة.
