שיטה זו יכולה לשמש כדי לסייע לחוקרים לנתח ולספור תרביות משותפות של תאים באמצעות ניתוח פשוט ויעיל המבוסס על שטח. טכניקה זו קלה יחסית ליישום באמצעות תוכנה זמינה באופן נרחב ומציעה אמצעי אמין ומדויק לזיהוי סוגי תאים שונים במסגרת תרבית משותפת. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופן שבו תרביות משותפות ספציפיות של תאים משתלבות כדי לסייע בהתחדשות רקמות.
ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לאמת מחקרי סמנים ביולוגיים של מונוקולטורה. בתור התחלה, תרבית גולמית 264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני להדמיית מונוקולטורה במיליליטר אחד של DMEM בתוספת FBS, פניצילין-סטרפטומיצין, נתרן ביקרבונט ובטא-מרקפטואתנול בבקבוקון תרבית תאים של חמישה מיליליטר בצפיפות של 25, 000 תאים לסנטימטר מרובע. תאי NIH/3T3 תרבית ב-DMEM בתוספת 10% FBS ו-1%פניצילין-סטרפטומיצין.
עבור הדמיה של תרבית משותפת, תרבית גולמית 264.7 מקרופאגים ופיברובלסטים NIH/3T3 באמצעות מדיום תרבית משותפת המכיל חלק אחד גולמי 264.7 בינוני וחלק אחד NIH/3T3 בינוני יחד ביחסים מגוונים וצפיפות כוללת של 25, 000 תאים לסנטימטר מרובע. לאחר הזריעה, הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני כדי להגיע לצפיפות תאים בת קיימא של 80% מפגש תאים. כדי להשיג תמונות של תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה של 40X, קבע את יכולת האלגוריתם להעריך במדויק תמונות עם טווח של איכויות תמונה.
רכשו תמונות בקנה מידה אפור עם מוקדים משתנים המייצרים תמונות שאינן בולבוס ובולבוס וייצאו אותן לקובץ czi הגולמי. כדי לקבל תמונות של תאים באמצעות השיטה מבוססת האזור, העתק והדבק את קובץ התמונה לניתוח לתוך הסל והזן את שם הקובץ על-ידי ביצוע הפקודה. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית.
נתח את התמונות על ידי פתיחה על ידי שחזור, ולאחר מכן סגירה על ידי שחזור באמצעות פונקציות מקור כדי להגדיל את החזית מהרקע על ידי ביצוע הפקודה המתאימה. כדי ליצור בינאריזציה של התמונות המשוחזרות באמצעות מערכת זיהוי מבוססת אחוזון, יש להבחין בין תאים לרקע על-ידי שימוש בהפרש אחוזונים מהפיקסל הרלוונטי המרבי, כאשר ערך הפיקסל הגדול ביותר מהווה לפחות 0.5% מתמונה נתונה. נתח והערך את ערכי הפיקסלים עבור מקרופאגים גולמיים של 264.7, כדי לוודא שהערכים נמצאים בטווח של 4.5% מהפיקסל הרלוונטי המרבי.
לאחר מכן סמן את הפיקסל כסלולרי. עבור תמונות המכילות פרופילים של תאי בולבוס, יש ליישם הליך איטרטיבי לתיקון עבור בינאריזציה שגויה במרכזי התאים. קבע ניחוש ראשוני עבור כיסוי התא הכולל.
הפעל את האלגוריתם ונתח תמונות באמצעות הערכות ראשוניות של אלפא וקפה כדי למלא חלק מהאיים. לאחר מכן השתמש בספירת התאים לאחר הניתוח ובכיסוי כדי לחשב מחדש את הקאפה. כדי לקבוע את שטח התא הממוצע לאחר בינאריזציה של התמונה, קבל וקטור של כל מיקומי המרכז ורדי של מעגלים שנמצאים בתוך התמונה על ידי ביצוע הפקודה.
השתמש ביציאות הרדידי כדי לחשב את שטח התא הממוצע על ידי ממוצע ולנתח לפחות 10 תאים כדי להבטיח זיהוי מדויק של האזור. בצע את ניתוח התמונה באמצעות הפקודות כמתואר קודם לכן. לאחר מכן ערכו ניתוח של תרביות משותפות המכילות תאים גולמיים 264.7 ו-NIH/3T3 על ידי קביעה ניסיונית של פרמטר phi באמצעות תמונות של תאים גולמיים 264.7 ו-NIH/3T3.
נחשו ערך phi ראשוני וחוזרים על עצמם עד שספירת התאים והכיסוי תואמים באופן הדוק את הספירות הידניות הספציפיות לתרבית המשותפת הגולמית 264.7 ו-NIH/3T3. קבע ספירת תאים גולמית של 264.7 בכיסוי התא הכולל כפי שתואר קודם לכן עבור תמונות המונוקולטורה. נתחו שוב את התמונה שעברה שינוי קו פרשת המים ללא הפרמטר phi, וזיהו גם מקרופאגים וגם פיברובלסטים.
רכוש נתונים פיברובלסטים של NIH/3T3 על-ידי חיסור סלקטיבי של 264.7 פיקסלים גולמיים של תאים שהתקבלו באמצעות שיטות הסף והכימות מבוססות השטח הסטנדרטיות שתוארו קודם לכן. בוצע ניתוח של מקרופאגים גולמיים שאינם בולבוס 264.7 ותועדו פלטי אלגוריתמים. חישובי שטח ממוצעים של התמונה באמצעות אלגוריתם ספרו 226 תאים, בעוד שספירה ידנית זיהתה 241 תאים עם ערך שגיאה משוער של 6% ניתוח של בולבוס גולמי 264.7 מקרופאגים בוצע גם כן.
חישובי השטח הממוצעים של התמונה באמצעות האלגוריתם ספרו 221 תאים, שאומתו על ידי ספירה ידנית של 252 תאים עם ערך שגיאה משוער של 12%ניתוח של תרביות משותפות המכילות הן מקרופאגים גולמיים של 264.7 והן פיברובלסטים של NIH/3T3 נערך. פלטי האלגוריתם עבור ספירת המקרופאגים הגולמית של 264.7 היו 137, בעוד שספירה ידנית זיהתה 155 תאים עם ערך שגיאה משוער של 11% כדי לקבוע את חוסנו של אלגוריתם ספירת התאים, חמש תמונות גולמיות של 264.7 מקרופאג'ים נספרו על ידי זיהוי תאים אוטומטי וספירת משתמשים ידנית. מקדם הקוביות התקבל בפרמטר ממוצע של 0.85 על פני חמש תמונות.
השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא השימוש בפרמטרים מבוססי אחוזון המאפשרים זיהוי תאים חזק הן במונוקולטורה והן בתמונות של תרבית משותפת. פרוטוקול זה יכול לשמש לזיהוי תאים בעלי עניין לניתוח נוסף באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית כדי להעריך סמנים ביולוגיים המגדירים אוכלוסיות תאים ספציפיות ופיתוח סמנים ביולוגיים במערכות של תרביות משותפות.
