이 프로토콜은 원발성 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하는 기술을 기술한다. 골육종 세포의 경골 내 주사에 의해,이 모델은 종양 골육종의 임상 발달 특성을 가장 잘 모방합니다. 골육종 세포의 정확한 수는 미세 부피 주사기를 사용하여 경골에 직접 주입되어 동일한 종양 형성 속도와 종양 부피를 허용합니다.
골육종 세포 주사 당일, PBS로 세포를 두 번 세척하십시오. 세포를 1.5 밀리리터의 0.25 % 트립신으로 3 분 동안 트립신화하십시오. 그런 다음 6 밀리리터의 10 % 혈청 함유 MEM 배지를 첨가하십시오.
세포를 15밀리리터 원심분리 튜브에 수집한다. 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 세포 계수 플레이트의 챔버 내로 흡인하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 계산한다. 세포를 실온에서 다섯 분 동안 800배 g에서 원심분리한다.
상층액을 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 밀리리터 당 8.5 밀리그램 기저막 매트릭스에 재현탁시킨 다음, 얼음 위에 놓는다. 마우스를 수핀 위치에 놓습니다. 엄지와 검지 손가락을 사용하여 마우스의 발목을 잡고 경골의 주사 부위를 70 % 에탄올 면봉으로 소독하십시오.
각 마우스의 발목 관절을 바깥쪽으로 돌려 경골과 비골을 움직이고 근위 경골 고원이 피부를 통해 보일 때까지 무릎 관절을 적절한 위치로 구부립니다. 바늘을 한 밀리리터 주사기에 부착하고 바늘 끝을 경골의 축과 평행한 주사 부위쪽으로 향하게하십시오. 경피적으로 바늘을 삽입하여 경골의 원위 끝쪽으로 경골 플랫폼을 통해 구멍을 뚫습니다.
이전에 얼음 위에 놓인 골육종 세포 현탁액을 미세 부피 주사기에 적재하고, 경골의 한 밀리리터 주사기를 골육종 세포가 로딩된 마이크로볼륨 주사기로 교체한다. 많은 압력을 가하지 않고 각 흉선 마우스의 경골에 약 10 마이크로 리터의 골육종 세포 현탁액을 천천히 주입하십시오. 그런 다음 주사 부위에서 미세 부피 주사기를 제거하고 면봉으로 약 30 초 동안 부위를 누릅니다.
마우스를 깨끗한 케이지에 다시 넣고 10 분 동안 회복을 관찰하십시오. 이 그림은 경골 내 골육종 세포 주사 및 이의 단리된 형태로부터 개발된 동위원소 골육종을 갖는 마우스 모델을 묘사한다. 종양 부피의 점진적인 증가는 매주 관찰됩니다.
루시페라아제 표지된 골육종 세포의 주사 후 첫 번째부터 여섯 번째 주까지 얻은 X선 이미지는 부피의 점진적인 증가를 보였다. 또한, 마우스 경골을 주사한 후 얻어진 이미지는 생체내에서 동위원소 골육종 성장을 보였다. 골육종 세포의 경골내 주사에 의해 유발된 폐 전이를 생체발광 라이브 이미징 시스템을 사용하여 생체내에서 성공적으로 추적하였다.
입체현미경으로 관찰한 결과, 분리된 폐 조직에서 전이성 콜로니가 드러났다. 파라핀 포매된 폐 조직에 대한 HE 염색은 전이성 병변을 보였다. 바늘은 슬개골 인대를 통해 관절 캡슐에 경피적으로 삽입되어 주사기를 회전시켜 경골 플랫폼을 통해 디지털 경골 쪽으로 구멍을 뚫어야합니다.
