このプロトコルは、原発性骨肉腫および肺転移病変を有するマウスモデルを生成する技術を記述する。骨肉腫細胞の脛骨内注射によって、このモデルは腫瘍骨肉腫の臨床発達特性を最もよく模倣する。正確な数の骨肉腫細胞は、マイクロボリュームシリンジを使用して脛骨に直接注入され、同一の腫瘍形成速度および腫瘍体積を可能にする。
骨肉腫細胞注射の日に、PBSで細胞を2回洗浄する。1.5ミリリットルの0.25%トリプシンで細胞を3分間トリプシン処理する。次いで、6ミリリットルの10%血清含有MEM培地を加える。
細胞を15ミリリットルの遠沈管に集める。20マイクロリットルの細胞懸濁液を細胞計数プレートのチャンバー内に吸引し、自動セルカウンターを用いて細胞濃度を算出した。細胞を800倍gで室温で5分間遠心分離する。
上清をピペットで吸引し、細胞ペレットを8.5ミリグラム/ミリリットルの基底膜マトリックスに再懸濁し、氷上に置きます。マウスを仰臥位に置きます。親指と人差し指でマウスの足首を持ち、脛骨の注射部位を70%エタノール綿棒で消毒します。
各マウスの足首関節を外側に回転させて脛骨と腓骨を動かし、近位脛骨プラトーが皮膚を通して見えるまで膝関節を適切な位置に曲げる。針を1ミリリットルのシリンジに取り付け、針先を脛骨の軸に平行な注射部位に向けて向ける。経皮的に針を挿入して、脛骨プラットフォームを通って脛骨の遠位端に向かって穴を開ける。
氷上に予め置いた骨肉腫細胞懸濁液をマイクロボリュームシリンジにロードし、脛骨内の1ミリリットルのシリンジを骨肉腫細胞搭載マイクロボリュームシリンジと交換する。約10マイクロリットルの骨肉腫細胞懸濁液を、あまり圧力をかけずに各無胸腺マウスの脛骨にゆっくりと注入する。その後、注射部位からマイクロボリュームシリンジを取り出し、綿棒で約30秒間部位を押す。
マウスを清潔なケージに戻し、10分間その回復を観察します。この図は、脛骨内骨肉腫細胞注射およびその単離された形態から発症した同所性骨肉腫を有するマウスモデルを描写する。腫瘍体積の漸進的な増加が毎週観察される。
ルシフェラーゼ標識骨肉腫細胞の注射後1週目から6週目にかけて得られたX線画像は、体積の漸進的な増加を示した。さらに、マウス脛骨への注射後に得られた画像は、生体内での同所性骨肉腫増殖を示した。骨肉腫細胞の脛骨内注射によって引き起こされる肺転移を、生物発光ライブイメージングシステムを用いてインビボで追跡することに成功した。
実体顕微鏡下での観察により、単離された肺組織における転移性コロニーが明らかになった。パラフィン包埋肺組織上のHE染色は転移性病変を示した。針は、膝蓋骨靭帯を介して関節カプセルに経皮的に挿入され、シリンジを回転させることによって、デジタル脛骨に向かって脛骨プラットフォームを介して穴をあけるべきである。
