Bu protokol, primer osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturma tekniğini açıklar. Osteosarkom hücrelerinin intratibiyal enjeksiyonu ile, bu model tümör osteosarkomunun klinik gelişim özelliklerini en iyi şekilde taklit eder. Doğru sayıda osteosarkom hücresi, aynı tümör oluşum hızlarına ve tümör hacimlerine izin veren bir mikro hacimli şırınga kullanılarak tibiaya doğrudan enjekte edilir.
Osteosarkom hücre enjeksiyonu gününde, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri üç dakika boyunca 1.5 mililitre% 0.25 tripsin ile tripsinize edin. Daha sonra altı mililitre% 10 serum içeren MEM ortamı ekleyin.
Hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Hücre sayma plakasının odasına 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu aspire edin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 kez g'de santrifüj yapın.
Süpernatantı bir pipetle aspire edin, hücre peletini mililitre başına 8.5 miligramlık bir bazal membran matrisinde yeniden askıya alın ve buzun üzerine yerleştirin. Fareyi sırtüstü konuma getirin. Başparmak ve işaret parmağını kullanarak farenin ayak bileğini tutun ve tibianın enjeksiyon bölgesini %70 etanol çubukla dezenfekte edin.
Tibia ve fibulayı hareket ettirmek için her farenin ayak bileği eklemini dışa doğru döndürün ve proksimal tibia platosu deriden görünene kadar diz eklemini uygun bir konuma getirin. İğneyi bir mililitrelik bir şırıngaya takın ve iğne ucunu tibia eksenine paralel olarak enjeksiyon bölgesine doğru doğrultun. Tibia platformundan tibianın distal ucuna doğru bir delik açmak için iğneyi perkütan olarak yerleştirin.
Daha önce buz üzerine yerleştirilen osteosarkom hücre süspansiyonunu bir mikro hacimli şırıngaya yükleyin ve tibiadaki bir mililitrelik şırıngayı osteosarkom hücresi yüklü mikro hacimli şırınga ile değiştirin. Çok fazla basınç uygulamadan her bir atimik farenin tibiasına yaklaşık 10 mikrolitre osteosarkom hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin. Daha sonra mikro hacimli şırıngayı enjeksiyon bölgesinden çıkarın ve bölgeye pamuklu çubukla yaklaşık 30 saniye boyunca bastırın.
Fareyi tekrar temiz bir kafese yerleştirin ve iyileşmesini 10 dakika boyunca gözlemleyin. Bu şekil, intratibial osteosarkom hücre enjeksiyonundan geliştirilen ortotopik osteosarkomlu fare modelini ve izole formunu göstermektedir. Her hafta tümör hacminde kademeli bir artış gözlenir.
Lusiferaz etiketli osteosarkom hücrelerinin enjeksiyonundan sonraki ilk haftadan altıncı haftaya kadar elde edilen X-ışını görüntüleri, hacimde kademeli bir artış gösterdi. Ayrıca, fare tibisine enjeksiyondan sonra elde edilen görüntü, in vivo olarak ortopik osteosarkom büyümesi gösterdi. Osteosarkom hücrelerinin intratibiyal enjeksiyonunun neden olduğu pulmoner metastazı, biyolüminesans canlı görüntüleme sistemi kullanılarak in vivo olarak başarıyla izlendi.
Stereomikroskop altında yapılan gözlem, izole akciğer dokularında metastatik koloniler olduğunu ortaya koydu. Parafin gömülü akciğer dokularında HE boyaması metastatik lezyonlar gösterdi. İğne, şırıngayı döndürerek tibia platformundan dijital tibiaya doğru bir delik açmak için patellar ligament yoluyla eklem kapsülüne perkütan olarak sokulmalıdır.
