Dieses Protokoll beschreibt die Technik zur Generierung von Mausmodellen mit primärem Osteosarkom und den pulmonalen Metastasenläsionen. Durch die intratibiale Injektion von Osteosarkomzellen ahmt dieses Modell die klinischen Entwicklungsmerkmale des Tumorosteosarkoms am besten nach. Eine genaue Anzahl von Osteosarkomzellen wird mit einer Mikrovolumenspritze direkt in die Tibia injiziert, was identische Tumorbildungsraten und Tumorvolumina ermöglicht.
Am Tag der Osteosarkom-Zellinjektion waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Trypsinisieren Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern 0,25% Trypsin für drei Minuten. Dann fügen Sie sechs Milliliter 10% serumhaltige MEM-Medien hinzu.
Sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Saugen Sie 20 Mikroliter Zellsuspension in die Kammer der Zellzählplatte und berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem automatischen Zellzähler. Zentrifen Sie die Zellen bei 800 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette ab, suspendieren Sie das Zellpellet in einer 8,5-Milligramm-pro-Milliliter-Basalmembranmatrix und legen Sie sie auf Eis. Stellen Sie die Maus in Rückenlage. Halten Sie den Knöchel der Maus mit Daumen und Zeigefinger fest und desinfizieren Sie die Injektionsstelle der Tibia mit einem 70% igen Ethanolabstrich.
Drehen Sie das Sprunggelenk jeder Maus nach außen, um die Tibia und das Wadenbein zu bewegen, und beugen Sie das Kniegelenk in eine geeignete Position, bis das proximale Tibiaplateau durch die Haut sichtbar ist. Befestigen Sie die Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze und richten Sie die Nadelspitze parallel zur Tibiaachse auf die Injektionsstelle. Führen Sie die Nadel perkutan ein, um ein Loch durch die Tibia-Plattform in Richtung des distalen Endes der Tibia zu bohren.
Laden Sie die zuvor auf Eis gelegte Osteosarkom-Zellsuspension in eine Mikrovolumenspritze und ersetzen Sie die Ein-Milliliter-Spritze in der Tibia durch die mit Osteosarkomzellen beladene Mikrovolumenspritze. Injizieren Sie langsam etwa 10 Mikroliter Osteosarkom-Zellsuspension in die Tibia jeder athymischen Maus, ohne viel Druck auszuüben. Entfernen Sie dann die Mikrovolumenspritze von der Injektionsstelle und drücken Sie die Stelle mit dem Wattestäbchen etwa 30 Sekunden lang an.
Setzen Sie die Maus zurück in einen sauberen Käfig und beobachten Sie ihre Erholung für 10 Minuten. Diese Abbildung zeigt das Mausmodell mit orthotopem Osteosarkom, das sich aus der intratibialen Osteosarkom-Zellinjektion entwickelt hat, und seiner isolierten Form. Jede Woche wird eine allmähliche Zunahme des Tumorvolumens beobachtet.
Die Röntgenbilder, die von der ersten bis zur sechsten Woche nach der Injektion von Luciferase-markierten Osteosarkomzellen aufgenommen wurden, zeigten eine allmähliche Zunahme des Volumens. Darüber hinaus zeigte das nach der Injektion in die Maustibia erhaltene Bild ein orthotopes Osteosarkomwachstum in vivo. Die durch die intratibielle Injektion der Osteosarkomzellen verursachte pulmonale Metastasierung wurde in vivo mit einem Biolumineszenz-Live-Imaging-System erfolgreich verfolgt.
Die Beobachtung unter einem Stereomikroskop ergab metastasierende Kolonien in den isolierten Lungengeweben. Die HE-Färbung auf paraffineingebettetem Lungengewebe zeigte metastasierende Läsionen. Die Nadel sollte perkutan durch das Patellaband in die Gelenkkapsel eingeführt werden, um ein Loch durch die Tibia-Plattform in Richtung der digitalen Tibia zu bohren, indem die Spritze gedreht wird.
