Эта вертикаль представляет собой важные этапы в сборке хроматографических колонок сродства клеточной мембраны с функциональными трансмембранными рецепторами. Эти колонки могут быть использованы для идентификации малых молекул, присутствующих в сложных экстрактах и взаимодействующих с иммобилизованными трансмембранными рецепторами. Колонки клеточной мембранной хроматографии ускоряют идентификацию биологически активных соединений, присутствующих в сложных смесях.
Использование колонок хроматографии сродства клеточной мембраны может представлять особый интерес для тех, кто заинтересован в идентификации фармакологически активных соединений, присутствующих в сложных природных матрицах, таких как растительные, грибковые или бактериальные экстракты. Для начала приготовьте 200 миллимолярных растворов бензамидина, растворив 120 бензамидина в пяти миллилитрах сверхчистой деионизированной воды. Приготовьте 10-миллимолярный раствор PMSF, растворив 0,017 г PMSF в 10 миллилитрах этанола в вытяжке.
Приготовьте коктейль ингибиторов протеаз 100X, растворив коммерчески доступную смесь ингибиторов протеазы в одном миллилитре сверхчистой деионизированной воды. Тщательно перемешать и аликвотировать от 200 до 300 микролитров коктейля. Готовят 100 миллимолярных спиртовых растворов АТФ, растворяя 55,114 миллиграммов гидрата динатриевой соли АТФ в одном миллилитре ионизированной сверхчистой воды.
Тщательно перемешать и аликвотировать 100 микролитров смеси. Приготовьте буфер, растворив 3,03 г Tris-HCL, 2,9 г хлорида натрия, 0,22 г безводного хлорида кальция, 0,2 г гексагидрата хлорида магния и 0,19 г хлорида калия в 500 миллилитрах сверхчистой деионизированной воды. Готовят буфер гомогенизации путем смешивания 17,3 миллилитра буфера Триса с 0,3 миллилитрами раствора бензамидина, 0,2 миллилитрами раствора PMSF, 0,2 миллилитрами коктейля ингибитора протеаз, 20 микролитрами раствора АТФ, двумя миллилитрами глицерина и 0,029 г ЭДТА.
Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью раствора соляной кислоты. Открутите клетки, собранные при четырех градусах Цельсия, в течение пяти минут при 400 х г и удалите супернатант и промыте оставшуюся ячейку гранулы 10 миллилитрами 1X рН 7,4 ледяного холода PBS. Отбросьте супернатант и добавьте 20 миллилитров буфера гомогенизации.
Поместите коническую трубку на лед. Перенесите клеточную суспензию в 40-миллилитровый гомогенизатор ткани Dounce, гомогенизируйте суспензию вручную на льду, используя 40 ударов пестика вверх и вниз. Перенесите гомогенизированную клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 миллилитров, выбросьте гранулу и перенесите супернатант в новую коническую трубку.
Сохраните гранулу клеточной мембраны и выбросьте супернатант. Готовят солюбилизационный буфер путем смешивания 8,7 миллилитра буферного раствора с 0,1 миллилитрами раствора PMSF, 0,15 миллилитрами раствора бензамидина, 0,1 миллилитрами коктейля ингибитора протеаз, 10 микролитрами раствора АТФ, одним миллилитрами глицерина и 0,2 г холата натрия. Перенесите буфер солюбилизации в коническую трубку с фрагментами клеточной мембраны.
И повторно суспендировать гранулу. Вращайте полученную смесь со скоростью 150 оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия в течение 18 часов. Через 18 часов центрифугируют солюбилизационную смесь при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут при 47 900 х г.
Добавьте 100 миллиграммов IAM. ПК. Частицы DD2 относят к надосадочному веществу и вращают полученную суспензионную смесь со скоростью 150 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Приготовьте диализный буфер в четырех литрах сверхчистой деионизированной воды, добавив 24 грамма Tris-HCl, 23,4 г хлорида натрия, 0,06 г хлорида кальция, 5,85 г ЭДТА и 0,07 г PMSF.
Растворите PMSF сначала в небольшом объеме этанола, а затем медленно добавьте в стакан с буфером. Отрежьте 10 сантиметров диализной трубки целлюлозной мембраны, чтобы подготовить диализную трубку, и перенесите суспензию, содержащую IAM. ПК. Частицы DD2 и фрагменты клеточной мембраны попадают в диализную трубку.
Закройте оба конца диализной трубки зажимами диализных трубок. Поместите диализную трубку в диализный буфер. Через 24 часа поместите диализную трубку в свежеприготовленный диализный буфер и продолжайте диализ еще 24 часа.
Приготовьте 10 миллимоляров pH 7,4 аммонатного ацетатного буфера, который будет использоваться для промывки IAM. ПК. Частицы DD2 и эксперименты по характеристике колонн путем растворения 0,778 грамма ацетата аммония в одном литре сверхчистой деионизированной воды. После 48 часов диализа извлеките диализную трубку из диализного буфера и перенесите содержимое диализной трубки в коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Откажитесь от супернатанта и трижды промойте оставшуюся гранулу 10 миллилитрами буфера ацетата аммония. После третьей промывки повторно суспендируют оставшуюся гранулу в одном миллилитре буфера ацетата аммония. Тщательно перемешайте его и используйте полученную суспензию, чтобы упаковать стеклянную колонку 5 x 20, чтобы получить колонку хроматографии CMAC.
Чтобы упаковать колонну, поместите нижний фильтр, предварительно пропитанный буфером ацетата аммония, в фильтродержатель. Установите фильтродержатель в стеклянную колонну и прикрутите крышку колонны, чтобы закрепить положение держателя. Поместите колонну вертикально в зажим для пальцев и закрепите ее на лабораторной подставке.
Поместите стакан под колонну, медленно переложите небольшой объем суспензии в стеклянную колонну с помощью одноканального пипетки, удерживающего наконечник пипетки у стенки стеклянной колонны. Чтобы ускорить процесс упаковки, снимите буфер сверху неподвижного слоя с помощью микропипетки между каждым шагом. Поместите верхний фильтр и прикрутите адаптер так, чтобы над неподвижной фазой не оставалось буфера.
Закрепите положение адаптера с помощью замка адаптера. Подключите колонну к высокоэффективному жидкостному хроматографическому насосу, а для промывки колонны на ночь буфером ацетата аммония установите скорость потока на уровне 0,2 миллилитра в минуту. Для более длительного хранения запустите колонну с 0,05% раствором азида натрия в буфере ацетата аммония, надев лабораторный халат, защитные очки и перчатки при работе с азидом натрия и храните при четырех градусах Цельсия.
ПК. Частицы DD2 с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны TrkB нейробластомы и в присутствии BDNF приводили к образованию флуоресцентных частиц. Флуоресценция не наблюдалась в инкапсулированных частицами IAM нулевой клеточной мембраны TrkB или когда не использовался BDNF, как в инкапсулированных частицами IAM клеточной мембраны TrkB. Показана функциональная CMAC-колонка типичной фронтальной аффинной хроматограммы увеличения 7, 8-DHF концентраций одного миллимоляра, 750 наномоляра, 500 наномоляра и 300 наномоляра к иммобилизованным рецепторам TrkB, что показало зависящее от концентрации изменение времени удержания.
Нефункциональная колонка CMAC показала отсутствие зависящих от концентрации изменений в удержании маркерного лиганда. Отрицательный контрольный столбец CMAC был получен путем иммобилизации фрагментов клеточной мембраны, не экспрессируя целевой белок, чтобы исключить неспецифические взаимодействия. Добавление 0,2% водного экстракта Готу кола приводило к значительному снижению удержания 7, 8-DHF, что указывает на наличие конкурирующих лигандов для сайта связывания агонистов.
Отсутствие снижения удержания 7, 8-DHF на нулевом столбце CMAC отрицательного TrkB дополнительно подтвердило отсутствие функциональных рецепторов TrkB на этом столбце. Отсутствующий подход пиковой хроматографии идентифицировал соединение, сильно сохранившееся в колонке TrkB, в то время как элюирование на ранней стадии нулевого столбца TrkB, что указывает на специфическое взаимодействие. Очень важно знать свой источник рецепторов для колонок хроматографии быстрого сродства клеточной мембраны.
Обязательно проверьте литературу, чтобы правильно спроектировать буферы гомогенизации и солюбилизации. Колонка клеточной мембранной хроматографии, подготовленная в этом протоколе, была использована для выявления новых потенциальных попаданий препарата и для характеристики характера взаимодействия между иммобилизованным рецептором и его естественными лигандами.
