Esta vertical apresenta passos importantes na montagem de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular com receptores de transmembrano funcionais. Estas colunas podem ser utilizadas para a identificação de pequenas moléculas presentes em extratos complexos e interagindo com receptores transmembrano imobilizados. As colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular aceleram a identificação de compostos biologicamente ativos presentes em misturas complexas.
O uso de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular pode ser de particular interesse para os interessados na identificação de compostos farmacologicamente ativos presentes em matrizes naturais complexas, como extratos vegetais, fúngicos ou bacterianos. Para começar, prepare 200 milimães de benzamidina, dissolvendo 120 de benzamidina em cinco mililitros de água desionizada ultrapura. Prepare uma solução de estoque PMSF de 10 milimões dissolvendo 0,017 gramas de PMSF em 10 mililitros de etanol em um capô de fumaça.
Prepare o coquetel inibidor de proteases 100X dissolvendo a mistura inibidora de protease comercialmente disponível em um mililitro de água desionizada ultrapure. Misture bem e alíquota de 200 a 300 microliters do coquetel. Prepare 100 milimilhas de solução de ações ATP dissolvendo 55.114 miligramas de sal de disódio ATP hidratar em um mililitro da água ultrapura ionizada.
Misture bem e aliquot 100 microlitres da mistura. Prepare o tampão dissolvendo 3,03 gramas de Tris-HCL, 2,9 gramas de cloreto de sódio, 0,22 gramas de cloreto de cálcio anidro, 0,2 gramas de hexahidrato de cloreto de magnésio e 0,19 gramas de cloreto de potássio em 500 mililitros de água desionizada ultrapurina. Prepare o tampão de homogeneização misturando 17,3 mililitros do tampão Tris com 0,3 mililitros de solução de estoque de benzamidina, 0,2 mililitros de solução de estoque PMSF, 0,2 mililitros de coquetel inibidor de proteases, 20 microliters de solução de estoque ATP, dois mililitros de glicerol e 0,029 gramas de EDTA.
Ajuste o pH para 7,4 usando solução de ácido clorídrico. Gire as células colhidas a quatro graus Celsius por cinco minutos a 400 x g e remova o supernasce e lave a pelota de célula restante com 10 mililitros de 1X pH 7,4 PBS gelado. Descarte o supernascimento e adicione 20 mililitros de tampão de homogeneização.
Coloque o tubo cônico no gelo. Transfira a suspensão celular para um moedor de tecido homogeneizador Dounce de 40 mililitros, homogeneize a suspensão manualmente no gelo usando 40 derrames de pilão para cima e para baixo. Transfira a suspensão celular homogeneizada em um tubo cônico de 50 mililitros, descarte a pelota e transfira o sobrenante para um novo tubo cônico.
Salve a pelota da membrana celular e descarte o supernasce. Prepare o tampão de solubilização misturando 8,7 mililitros da solução tampão com 0,1 mililitros de solução de estoque PMSF, 0,15 mililitros de solução de estoque de benzamidina, 0,1 mililitros de coquetel inibidor de proteases, 10 microliters de solução de estoque ATP, um mililitro de glicerol e 0,2 gramas de controcínola de sódio. Transfira o tampão de solubilização para o tubo cônico com fragmentos de membrana celular.
E resuspense a pelota. Gire a mistura resultante a 150 RPM a quatro graus Celsius durante 18 horas. Após 18 horas, centrifugar a mistura de solubilização a quatro graus Celsius por 30 minutos a 47.900 x g.
Adicione 100 miligramas de IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 para o supernante e gire a mistura de suspensão resultante a 150 RPM a quatro graus Celsius por uma hora. Prepare o tampão de diálise em quatro litros de água desionizada ultrapura adicionando 24 gramas de Tris-HCl, 23,4 gramas de cloreto de sódio, 0,06 gramas de cloreto de cálcio, 5,85 gramas de EDTA e 0,07 gramas de TPM.
Dissolver o PMSF primeiro em um pequeno volume de etanol e, em seguida, adicionar lentamente no béquer com o buffer. Corte 10 centímetros de tubo de diálise de membrana de celulose para preparar o tubo de diálise e transfira a suspensão contendo IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 e fragmentos de membrana celular no tubo de diálise.
Feche as duas extremidades do tubo de diálise com clipes de tubo de diálise. Coloque o tubo de diálise no tampão de diálise. Após 24 horas, coloque a tubulação de diálise no tampão de diálise recém-preparado e a diálise continuada por mais 24 horas.
Prepare 10 milimões pH 7.4 tampão de acetato de amônio que será usado para lavar o IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 e experimentos de caracterização de colunas dissolvendo 0,778 gramas de acetato de amônio em um litro de água ultrapura deionizada. Após 48 horas de diálise, remova o tubo de diálise do tampão de diálise e transfira o conteúdo do tubo de diálise para um tubo cônico de 15 mililitros.
Descarte o supernatante e lave a pelota restante três vezes com 10 mililitros de tampão de acetato de amônio. Após a terceira lavagem, resuspenja a pelota restante em um mililitro de tampão de acetato de amônio. Misture bem e use o chorume resultante para embalar a coluna de vidro 5 x 20 para produzir a coluna de cromatografia CMAC.
Para embalar a coluna, coloque um filtro inferior previamente encharcado com tampão de acetato de amônio no suporte do filtro. Coloque o suporte do filtro na coluna de vidro e enrosque a tampa da coluna para fixar a posição do titular. Coloque a coluna verticalmente em um grampo de dedo e fixe-a no suporte do laboratório.
Coloque um béquer abaixo da coluna, transfira um pequeno volume do chorume para a coluna de vidro lentamente com uma única pipeta de canal segurando a ponta da pipeta contra a parede da coluna de vidro. Para acelerar o processo de embalagem, remova o tampão de cima da cama estacionária com uma micropipette entre cada passo. Coloque um filtro superior e enrosque a unidade adaptador para que não haja um buffer restante acima da fase estacionária.
Fixar a posição da unidade adaptadora com a trava do adaptador. Conecte a coluna a uma bomba de cromatografia líquida de alto desempenho e, para lavar a coluna durante a noite com tampão de acetato de amônio, defina a taxa de fluxo para 0,2 mililitros por minuto. Para maior armazenamento, execute a coluna com solução de azida de sódio de 0,05% em tampão de acetato de amônio, usando um jaleco, óculos de segurança e luvas ao trabalhar com azida de sódio e armazene a quatro graus Celsius.IAM.
Computador pessoal. Partículas DD2 com fragmentos de membrana celular TrkB de neuroblastoma imobilizado e na presença de BDNF resultaram em partículas fluorescentes. Nenhuma fluorescência foi observada na membrana de células nulas TrkB encapsuladas partículas IAM ou quando nenhum BDNF foi usado como na membrana celular TrkB encapsulada partículas IAM. Um cromatograma típico de afinidade frontal de 7, 8-DHF funciona de um mililitro, 750 nanomolar, 500 nanomolar e 300 nanomolar aos receptores TrkB imobilizados, que mostraram uma mudança dependente de concentração no tempo de retenção.
Uma coluna CMAC não funcional mostrou a falta de concentração de alterações dependentes na retenção do ligante marcador. Uma coluna de controle negativo do CMAC foi preparada pela imobilização de fragmentos de membrana celular, não expressando a proteína alvo para excluir interações não específicas. A adição de extrato de Gotu kola 0,2% aquoso resultou em uma redução significativa da retenção de 7, 8-DHF, indicando a presença de ligantes concorrentes para o local de ligação agonista.
A falta de redução da retenção de 7, 8-DHF na coluna nula CMAC negative TrkB confirmou ainda a falta de receptores TrkB funcionais nesta coluna. A abordagem cromatografia de pico ausente identificou um composto fortemente retido na coluna TrkB, enquanto eluvava-se cedo na coluna nula TrkB, indicando interação específica. É crucial saber sua fonte de receptores para uma coluna de cromatografia de afinidade de membrana celular rápida.
Certifique-se de verificar a literatura para projetar corretamente buffers de homogeneização e solubilização. A coluna de cromatografia de afinidade de membrana celular preparada neste protocolo foi utilizada para identificar novos potenciais impactos medicamentosos e caracterizar a natureza da interação entre receptor imobilizado e seus ligantes naturais.
