DetectSyn aprovecha la tecnología de ensayo de ligadura de proximidad para identificar rápidamente los cambios en las sinapsis. También proporcionamos un protocolo para analizar los resultados. La principal ventaja de DetectSyn es la rapidez con la que se pueden obtener los resultados en las grandes regiones de tejido que se pueden analizar.
Para comenzar, retire cuidadosamente la solución de bloqueo con una pipeta Pasteur de plástico sin perturbar las células. Luego forra una gran placa de Petri de plástico con Parafilm. Y usando fórceps, transfiera cuidadosamente los resbalones de la cubierta al Parafilm.
Agregue 60 microlitros de la solución de anticuerpos primarios a la parte superior del resbalón de la cubierta, asegurándose de que la solución de anticuerpos no se derrame sobre los lados del deslizamiento de la cubierta. Para proporcionar humedad y evitar que las muestras se sequen durante la incubación, agregue agua ultrapura a una placa de Petri más pequeña y coloque cuidadosamente la placa alrededor de los resbalones de la cubierta. Luego cubra la placa de Petri más grande e incube las células cultivadas durante una hora a temperatura ambiente.
Después de la incubación con el anticuerpo primario, use fórceps para golpear cuidadosamente la solución de anticuerpos primarios de los resbalones de la cubierta en una toalla de papel y transfiera los trozos de la cubierta a su placa original de 24 pocillos llena de 500 microlitros de PBS. Luego lave las muestras con PBS tres veces durante 10 minutos cada una con una agitación suave en un agitador orbital. Después del último lavado, transfiera los resbalones de la cubierta a la placa de Petri grande y agregue 40 microlitros de la solución de anticuerpos secundaria a la parte superior del deslizamiento de la cubierta.
Cubra la placa de Petri e incube las muestras a 37 grados centígrados durante una hora. Para la ligadura, mientras mantiene la ligasa en un bloque frío, diluya la ligasa 1 a 40 usando el material de ligadura e inmediatamente agregue 40 microlitros de la mezcla de ligasa a los resbalones de la cubierta. Cubra la placa de Petri e incube las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Para la amplificación, diluya la polimerasa 1280 en un bloque frío utilizando el material de amplificación. Luego agregue 40 microlitros de la mezcla de amplificación a los resbalones de la cubierta e incube las muestras durante 100 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, para el montaje, deje caer tres microlitros de medios de montaje en una diapositiva.
Retire el exceso de búfer de lavado del resbalón de la cubierta y coloque el resbalón de la cubierta con las celdas hacia abajo en el medio de montaje. Selle los lados con una pequeña cantidad de esmalte de uñas transparente para mantener el deslizamiento de la cubierta en su lugar. Para el montaje de tejido en rodajas, transfiera cuidadosamente una rebanada de tejido al portaobjetos preparado y colóquelo plano.
Luego deje caer de 5 a 10 microlitros de medios de montaje en la rebanada de tejido. Coloque un resbalón de cubierta de vidrio sobre la rebanada de tejido y selle el resbalón de la cubierta con esmalte de uñas transparente, como se demostró anteriormente. Para obtener imágenes digitales con un microscopio confocal, ajuste la ganancia, el desplazamiento y la potencia del láser para cada canal fluorescente para disminuir el ruido de fondo y mejorar la señal fluorescente.
Asegúrese de que la señal fluorescente no esté sobresaturada. Para las neuronas de cultivo, en la pestaña Adquisición de ND, haga clic en Guardar en archivo. Luego, en Examinar, elija un archivo para guardar la imagen e ingrese el nombre del archivo.
A continuación, en la pestaña Z, seleccione la opción Modo simétrico definido por rango. Establezca el enfoque en el mejor mapa de dos planos y haga clic en el botón Relativo para establecer este plano focal como el centro de la pila z. A continuación, ajuste el rango a cinco micrómetros con pasos de un micrómetro y marque Cerrar obturador activo durante el movimiento Z.
En la pestaña Longitud de onda, seleccione el nombre del botón óptico con los ajustes de adquisición configurados previamente en Configuración óptica y haga clic en Ejecutar ahora. Para el tejido en rodajas, en el menú adquirir, elija Escanear imagen grande y, a continuación, en el panel de captura, seleccione el botón óptico con los ajustes de adquisición configurados previamente. Además, seleccione el objetivo correcto en este panel.
A continuación, debajo del panel de área y el ocular, use las teclas de flecha para establecer los límites de la región de interés o ROI. Luego haga clic en Guardar imagen grande en archivo y cree un nombre de archivo de ruta de guardado para la imagen. Finalmente, en el panel de configuración, asegúrese de que la captura multicanal esté marcada.
A continuación, elija el nombre del botón óptico con los ajustes de adquisición configurados previamente en Configuración óptica. En ImageJ, abra la opción de umbral yendo al menú de la imagen, haciendo clic en Ajustar y luego en Umbral. Elija la opción Fondo oscuro si la imagen tiene un fondo oscuro.
A continuación, ajuste los límites superior e inferior del umbral según la configuración de umbral optimizada previamente determinada y haga clic en Aplicar. Para las células cultivadas, utilice el canal MAP2 y una herramienta de ROI a mano alzada para dibujar un ROI para cada neurona, incluidas las dendritas y el soma. Para el tejido en rodajas, dibuje un ROI a mano alzada dentro de la imagen de la rebanada que encapsule el área de interés.
Luego obtenga el área del ROI abriendo el menú Analizar y haciendo clic en Medir. Para detectar el número de puntas dentro de cada ROI, utilice una herramienta de detección automática como el análisis de partículas. En el menú Analizado, seleccione Partículas analizadas y defina el diámetro del tamaño de la punta.
A continuación, en el menú desplegable mostrar, elija la opción Máscaras superpuestas, luego marque la opción Mostrar resultados y haga clic en Aceptar. Para dividir el número de punta por el área del ROI individual, copie y pegue los resultados de cada imagen de los resultados emergentes en una hoja de cálculo. Identificar de qué archivo y muestra los datos que obtenemos, y dividir el área del ROI por el número de punta.
Finalmente, para normalizar los resultados a muestras de control, promediar los resultados de las muestras de control y dividir los resultados obtenidos de todas las muestras por el promedio del control. El agonista GABAB, baclofeno, es necesario para la eficacia in vitro del antidepresivo rápido Ro-256981. Un aumento en la formación de sinapsis se demuestra por un aumento en la punta blanca.
Sin baclofeno, no se observa un aumento en la formación de sinapsis. In vivo, la inyección intraperitoneal del antidepresivo rápido resulta en un aumento en la formación de sinapsis en comparación con el control salino. Si bien algunas puntas aparecen en las imágenes de control técnico, generalmente no son del mismo tamaño que lo demuestra la especificación blanca en comparación con la punta grande en los otros paneles.
Además, estas puntas no están en el mismo lugar como lo demuestra alguna punta que aparece dentro del soma. DetectSyn puede identificar cambios en las sinapsis debido a un estado de enfermedad o tratamiento farmacológico. Este método puede ayudar a proporcionar información sobre cualquier área de investigación que estudie los trastornos que afectan el desarrollo o la descomposición de las sinapsis.
