Nuestro protocolo describe el diseño, ensamblaje y validación de diagnósticos basados en circuitos genéticos. Estos diagnósticos moleculares basados en papel son de bajo costo y sensibles, pudiendo detectar concentraciones clínicamente relevantes de ácidos nucleicos y pueden diseñarse para detectar prácticamente cualquier secuencia. Esta es una tecnología de plataforma que puede ser diseñada por los usuarios para sus necesidades y tiene el potencial de llevar diagnósticos de grado clínico a entornos de recursos dentales más descentralizados.
El sensor de interruptor de punto de apoyo sin células se puede diseñar para prácticamente cualquier objetivo basado en ácidos nucleicos. Trabajos recientes han demostrado diagnósticos libres de células para el ébola, el norovirus, el SARS-CoV-2, C. difficile y las bacterias que causan la fiebre tifoidea. Demostrando el procedimiento estarán Severino Jefferson Rivero da Silva, becario postdoctoral, y Pouriya Bayat, estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Para diseñar el interruptor de punto de apoyo, identifique las secuencias objetivo del genoma del virus del Zika y elija las secuencias objetivo del virus del Zika de los amplicones como se describe en el protocolo de texto. Descargue el paquete de software de diseño del interruptor de punto de apoyo. Abra MATLAB y navegue hasta la carpeta del software de diseño.
Introduzca las secuencias de destino en el archivo csv del archivo de entrada de diseño ubicado en la subcarpeta de entrada. Seleccione los parámetros que desea utilizar para la función de diseño. Ejecute la función de diseño para generar los diseños de interruptores de punto de apoyo para los objetivos de interés.
Al finalizar, navegue hasta la carpeta final_designs y localice las secuencias de diseño del interruptor de punto de apoyo superior y las secuencias de destino correspondientes en hojas de cálculo en formato csv. Asegúrese de que las secuencias de ADN del interruptor de dedo del pie generadas por el algoritmo contengan las secuencias promotoras T7 en el extremo primo cinco y una secuencia conservada de enlace de 21 nucleótidos en el extremo primario tres. Utilice NCBI BLAST para comparar las secuencias de diseño del interruptor del punto de apoyo superior contra otros virus comunes comprobando la homología de secuencia.
Acepta secuencias con menos del 40% de hemología. Preparar soluciones de oligos de ADN de horquilla del interruptor de dedo del pie y cebadores de amplificación inversa a una concentración de 10 micromolares en agua libre de nucleasas. Ensamble las reacciones en tubos de PCR sobre hielo de acuerdo con esta tabla.
Coloque los tubos de reacción en un termociclador, siguiendo las condiciones de ciclo enumeradas en esta tabla. Analizar los productos de PCR en un gel de agarosa. Purificar los productos de PCR y eluyar el ADN en un volumen mínimo de agua libre de nucleasas para asegurar una concentración suficientemente alta.
Cuantificar el ADN usando un espectrofotómetro. Prepare una solución madre de CPRG disolviendo 25 miligramos del polvo en un mililitro de agua libre de nucleasas. Prepare una mezcla maestra en hielo de acuerdo con el protocolo estándar que se muestra aquí.
Dispense la mezcla maestra libre de células en tubos de PCR. Para controles sin células y controles de interruptor solo, agregue agua sin nucleasa a un volumen de 5.94 microlitros. Y para la reacción, agregue ADN de interruptor de punto purificado por PCR para obtener una concentración final de 33 nanomolares.
Para probar el interruptor del punto de apoyo y la combinación de ARN objetivo, agregue ARN objetivo transcrito in vitro a una concentración final de un micromolar. Mezclar bien todas las reacciones pipeteando y centrifugando brevemente. En una placa de 384 pocillos de fondo transparente negro, agregue 30 microlitros de agua libre de nucleasa a los pozos que rodean los pozos de reacción.
Luego, usando un punzón de biopsia de dos milímetros y pinzas, corte los discos de papel de filtro bloqueados por BSA y colóquelos en los pocillos de reacción. Dispense 1,8 microlitros de cada tubo de reacción en los discos de papel de filtro en la placa de 384 pocillos por triplicado. Cubra la placa con una película de PCR transparente y colóquela en un lector de placas.
Mida la absorbancia a 570 nanómetros a 37 grados centígrados cada minuto durante 130 minutos. Prepare una solución madre de 25 micromolares de todos los juegos de cebadores directos e inversos en agua libre de nucleasas. Configure una reacción de cinco microlitros utilizando la mezcla maestra que se muestra aquí.
Mezclar por pipeteo hasta que el precipitado blanco se solubilice y luego dispensar en tubos de PCR. Agregue los cebadores directos e inversos a los tubos apropiados, seguido de agregar un microlitro de agua libre de nucleasas o dos picomolares de ARN desencadenante objetivo. Mezclar con un pipeteo suave y girar brevemente los tubos.
Configure el protocolo de incubación en un termociclador como se muestra aquí. Después de 12 minutos, retire los tubos y agregue 1,25 microlitros de la mezcla de enzimas a cada tubo, seguido de la mezcla y la centrifugación. Devuelva los tubos al termociclador después de omitir el paso de retención de 41 grados centígrados para iniciar la incubación de reacción de una hora.
Luego, para evaluar el rendimiento de la imprimación, ensamble las reacciones del interruptor de punto de apoyo sin células en papel y analice los datos. Para el análisis de sensibilidad, identifique pares de cebadores candidatos y prepare diluciones seriadas de ARN objetivo en agua libre de nucleasas. Repita la NASBA y las reacciones libres de células con los conjuntos de cebadores seleccionados en triplicados biológicos.
Usando un microlitro de ARN del paciente extraído, realice la amplificación NASBA y las reacciones libres de células basadas en papel como se muestra en la sección cinco. Después de las reacciones, prepare la placa de reacción de 384 pocillos y ejecute el ensayo en un lector de placas portátil a 37 grados centígrados. Luego ensamble los componentes RT-qPCR y agregue los reactivos a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros de acuerdo con esta tabla.
Mezclar la reacción por pipeteo. Dispense 6,5 microlitros en cada pocillo de una placa de PCR de 96 o 384 pocillos, seguido de 3,5 microlitros de cada plantilla de ARN por triplicado. Coloque una película de PCR sobre la parte superior de la placa.
Centrifugar la placa de 384 pocillos a 600 veces G durante dos minutos. Coloque la placa en una máquina RT-qPCR y ejecute las condiciones de ciclismo como se muestra aquí. Después del diseño computacional, se construyeron tres interruptores de punto de apoyo y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
Una banda de alrededor de 3.000 pares de bases indicó una reacción exitosa. Los interruptores de punto de apoyo se evaluaron contra su respectivo ARN desencadenante transcrito in vitro. Mientras que los tres sensores mostraron un aumento en la absorbancia, el sensor 27B tuvo la velocidad de encendido más rápida, mientras que los interruptores 33B y 47B tuvieron una relación de encendido / apagado más baja que indica actividad de fondo y especificidad reducida.
El cambio de absorbancia de plegado a 570 nanómetros mostró que el interruptor 27B tiene el mejor rendimiento con una relación de señal de encendido / apagado. Además, cuando se combina con NASBA, puede detectar ARN en concentraciones tan bajas como 124 moléculas por microlitro, lo que indica una alta sensibilidad. Se analizaron muestras de pacientes con el virus del Zika de Brasil para evaluar la precisión diagnóstica clínica de los sensores utilizando un lector de placas portátil.
Un cambio de color de amarillo a púrpura identificó una muestra positiva. La respuesta colorimétrica para cada reacción basada en papel se trazó a lo largo del tiempo mediante el software integrado en el lector de placas portátil PLUM. Las muestras que excedieron el umbral se consideraron positivas.
El rendimiento clínico del sensor se estableció en comparación con RT-qPCR. Las muestras se consideraron positivas cuando el valor umbral del ciclo fue igual o inferior a 38. Es importante asegurarse de que los resultados de las pantallas del interruptor de punto de apoyo y la sensibilidad de la imprimación NASBA sean reproducibles y optimizados antes de seguir adelante con los ensayos con pacientes.
Dada su simplicidad y adaptabilidad, la plataforma de diagnóstico descrita aquí ha allanado el camino para el desarrollo de nuevas herramientas de punto de atención que pueden aportar beneficios al sistema de salud, especialmente para los países de bajos ingresos.
