يصف بروتوكولنا تصميم التشخيصات القائمة على الدوائر الجينية وتجميعها والتحقق من صحتها. هذه التشخيصات الجزيئية الورقية منخفضة التكلفة وحساسة ، حيث تكون قادرة على اكتشاف تركيزات الأحماض النووية ذات الصلة سريريا ويمكن تصميمها للكشف عن أي تسلسل تقريبا. هذه تقنية منصة يمكن تصميمها من قبل المستخدمين لتلبية احتياجاتهم ولديها القدرة على جلب التشخيصات السريرية إلى إعدادات موارد الأسنان اللامركزية.
يمكن تصميم مستشعر مفتاح تثبيت القدم الخالي من الخلايا لأي هدف قائم على الحمض النووي تقريبا. أظهرت الأعمال الأخيرة تشخيصات خالية من الخلايا للإيبولا والنوروفيروس و SARS-CoV-2 و C.difficile والبكتيريا المسببة للتيفوئيد. سيوضح الإجراء سيفيرينو جيفرسون ريفيرو دا سيلفا ، زميل ما بعد الدكتوراه ، وبوريا بايات ، طالبة دكتوراه من مختبري.
لتصميم مفتاح تثبيت القدم، حدد التسلسلات المستهدفة من جينوم فيروس زيكا واختر التسلسلات المستهدفة لفيروس زيكا من الأمبليكونات كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بتنزيل حزمة برامج تصميم مفتاح تثبيت القدم. افتح MATLAB وانتقل إلى مجلد برنامج التصميم.
أدخل التسلسلات الهدف في ملف csv لملف إدخال التصميم الموجود في مجلد الإدخال الفرعي. حدد المعلمات لاستخدامها في وظيفة التصميم. قم بتشغيل وظيفة التصميم لإنشاء تصميمات مفتاح تثبيت القدم للأهداف ذات الاهتمام.
عند الانتهاء ، انتقل إلى المجلد final_designs وحدد موقع تسلسلات تصميم مفتاح إصبع القدم العلوي والتسلسلات المستهدفة المقابلة في جداول بيانات بتنسيق csv. تأكد من أن تسلسل الحمض النووي لمفتاح تثبيت القدم الذي تم إنشاؤه بواسطة الخوارزمية يحتوي على تسلسلات المروج T7 في النهاية الأولية الخمسة وتسلسل رابط النوكليوتيدات 21 المحفوظ في النهاية الثلاثة الأولية. استخدم NCBI BLAST لفحص تسلسلات تصميم مفتاح تثبيت إصبع القدم العلوي مقابل الفيروسات الشائعة الأخرى عن طريق التحقق من تماثل التسلسل.
قبول التسلسلات مع أقل من 40٪ من الدم. تحضير حلول لمفتاح تثبيت إصبع القدم و hypolegos DNA وبادئات التضخيم العكسي بتركيز 10 ميكرومولار في ماء خال من النيوكلياز. قم بتجميع التفاعلات في أنابيب PCR على الجليد وفقا لهذا الجدول.
ضع أنابيب التفاعل في دراجة حرارية ، باتباع ظروف الدورة المدرجة في هذا الجدول. تحليل منتجات PCR على هلام agarose. تنقية منتجات PCR وتخفيف الحمض النووي في الحد الأدنى من حجم المياه الخالية من النيوكلياز لضمان تركيز عال بما فيه الكفاية.
تحديد كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تحضير محلول مخزون CPRG عن طريق إذابة 25 ملليغرام من المسحوق في ملليلتر واحد من الماء الخالي من النيوكلياز. قم بإعداد مزيج رئيسي على الجليد وفقا للبروتوكول القياسي الموضح هنا.
قم بتوزيع المزيج الرئيسي الخالي من الخلايا في أنابيب PCR. بالنسبة لعناصر التحكم الخالية من الخلايا وأدوات التحكم بالتبديل الفردي ، أضف الماء الخالي من النيوكلياز إلى حجم 5.94 ميكرولتر. وبالنسبة للتفاعل ، أضف PCR المنقى لمفتاح إصبع القدم DNA للحصول على تركيز نهائي قدره 33 نانومولار.
لاختبار مفتاح تثبيت القدم وتركيبة الحمض النووي الريبي المستهدف ، أضف الحمض النووي الريبي المستهدف المنسوخ في المختبر إلى التركيز النهائي لواحد ميكرومولار واحد. امزج جميع ردود الفعل جيدا عن طريق السحب والطرد المركزي لفترة وجيزة. على صفيحة سوداء شفافة القاع مكونة من 384 بئرا ، أضف 30 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز إلى الآبار المحيطة بآبار التفاعل.
ثم باستخدام لكمة خزعة 2 ملم وملاقط ، قطع أقراص ورق الترشيح المحظورة BSA ووضعها في آبار التفاعل. قم بتوزيع 1.8 ميكرولتر من كل أنبوب تفاعل على أقراص ورق الترشيح في لوحة البئر 384 في ثلاث نسخ. قم بتغطية اللوحة بفيلم PCR شفاف وضعها في قارئ الأطباق.
قم بقياس الامتصاص عند 570 نانومتر عند 37 درجة مئوية كل دقيقة لمدة 130 دقيقة. قم بإعداد محلول مخزون 25 ميكرومولار لجميع مجموعات التمهيدي الأمامية والخلفية في ماء خال من النيوكلياز. أعد تفاعل خمسة ميكرولتر باستخدام المزيج الرئيسي الموضح هنا.
تخلط عن طريق ماصة حتى يذوب الراسب الأبيض ثم الاستغناء في أنابيب PCR. أضف البادئات الأمامية والخلفية إلى الأنابيب المناسبة ، متبوعة بإضافة ميكرولتر واحد من الماء الخالي من النيوكلياز أو اثنين من بيكومولار من الحمض النووي الريبي المستهدف. تخلط عن طريق ماصة لطيفة وتدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب.
قم بإعداد بروتوكول الحضانة على دراجة حرارية كما هو موضح هنا. بعد 12 دقيقة ، قم بإزالة الأنابيب وإضافة 1.25 ميكرولتر من مزيج الإنزيم إلى كل أنبوب ، متبوعا بالخلط والطرد المركزي. أعد الأنابيب إلى العجلة الحرارية بعد تخطي خطوة الانتظار البالغة 41 درجة مئوية لبدء حضانة التفاعل لمدة ساعة واحدة.
ثم لتقييم أداء التمهيدي ، قم بتجميع تفاعلات مفتاح تثبيت القدم الخالية من الخلايا الورقية وتحليل البيانات. لتحليل الحساسية ، حدد أزواج التمهيدي المرشحة وقم بإعداد التخفيفات التسلسلية للحمض النووي الريبي المستهدف في الماء الخالي من النيوكلياز. كرر تفاعلات NASBA والخلايا الخالية مع مجموعات التمهيدي المحددة في ثلاث نسخ بيولوجية.
باستخدام ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي المستخرج للمريض ، قم بإجراء تضخيم NASBA والتفاعلات الخالية من الخلايا الورقية كما هو موضح في القسم الخامس. بعد التفاعلات ، قم بإعداد لوحة التفاعل المكونة من 384 بئرا وقم بتشغيل الفحص في قارئ لوحة محمول عند 37 درجة مئوية. ثم قم بتجميع مكونات RT-qPCR وإضافة الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر وفقا لهذا الجدول.
خلط رد الفعل عن طريق ماصة العينات. قم بتوزيع 6.5 ميكرولتر في كل بئر من لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل المكونة من 96 بئرا أو 384 بئرا ، متبوعا ب 3.5 ميكرولتر من كل قالب RNA في ثلاث نسخ. ضع فيلم PCR فوق الجزء العلوي من اللوحة.
جهاز طرد مركزي للوحة 384 بئرا عند 600 مرة G لمدة دقيقتين. ضع اللوحة في جهاز RT-qPCR وقم بتشغيل ظروف ركوب الدراجات كما هو موضح هنا. بعد التصميم الحسابي ، تم إنشاء ثلاثة مفاتيح لأصابع القدم وتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.
يشير النطاق حول 3،000 زوج أساسي إلى رد فعل ناجح. تم تقييم مفاتيح تثبيت القدم مقابل الحمض النووي الريبي المحفز المنسوخ في المختبر. في حين أظهرت جميع أجهزة الاستشعار الثلاثة زيادة في الامتصاص ، كان المستشعر 27B هو الأسرع في المعدل ، في حين أن المفتاحين 33B و 47B كان لهما نسبة تشغيل / إيقاف أقل تشير إلى نشاط الخلفية وخصوصية منخفضة.
أظهر تغيير أضعاف الامتصاص عند 570 نانومتر أن المفتاح 27B لديه أفضل أداء مع نسبة إشارة تشغيل / إيقاف. علاوة على ذلك ، عندما يقترن ب NASBA ، يمكنه اكتشاف الحمض النووي الريبي بتركيزات منخفضة تصل إلى 124 جزيئا لكل ميكرولتر مما يشير إلى حساسية عالية. واختبرت عينات من مرضى فيروس زيكا من البرازيل لتقييم دقة التشخيص السريري لأجهزة الاستشعار باستخدام قارئ لوحات محمول.
أدى تغير اللون من الأصفر إلى الأرجواني إلى تحديد عينة إيجابية. تم رسم الاستجابة اللونية لكل تفاعل ورقي بمرور الوقت بواسطة البرنامج المدمج على قارئ الألواح المحمولة PLUM. واعتبرت العينات التي تجاوزت العتبة إيجابية.
تم تحديد الأداء السريري للمستشعر بالمقارنة مع RT-qPCR. اعتبرت العينات موجبة عندما كانت قيمة عتبة الدورة تساوي أو تقل عن 38. من المهم التأكد من أن النتائج من شاشات تبديل أصابع القدم وحساسية NASBA التمهيدي قابلة للتكرار ومحسنة قبل المضي قدما في تجارب المرضى.
ونظرا لبساطتها وقدرتها على التكيف، مهدت منصة التشخيص الموصوفة هنا الطريق لتطوير أدوات جديدة لنقاط الرعاية يمكن أن تعود بالنفع على النظام الصحي، لا سيما بالنسبة للبلدان المنخفضة الدخل.
