우리의 프로토콜은 유전자 회로 기반 진단의 설계, 조립 및 검증을 설명합니다. 이러한 종이 기반 분자 진단은 비용이 저렴하고 민감하여 임상적으로 관련된 핵산 농도를 검출할 수 있으며 거의 모든 서열을 검출하도록 설계할 수 있습니다. 이것은 사용자가 필요에 맞게 설계할 수 있는 플랫폼 기술이며 임상 등급 진단을 보다 분산된 치과 리소스 설정으로 가져올 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
무세포 토홀드 스위치 센서는 거의 모든 핵산 기반 표적에 맞게 설계할 수 있습니다. 최근 연구에서는 에볼라, 노로 바이러스, SARS-CoV-2, C.difficile 및 장티푸스 유발 박테리아에 대한 무세포 진단이 입증되었습니다. 이 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원 인 Severino Jefferson Rivero da Silva와 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Pouriya Bayat입니다.
토홀드 스위치를 설계하려면 지카 바이러스 게놈에서 표적 서열을 식별하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 앰플리콘에서 지카 바이러스 표적 서열을 선택합니다. 토홀드 스위치 설계 소프트웨어 패키지를 다운로드하십시오. MATLAB을 열고 설계 소프트웨어 폴더로 이동합니다.
입력 하위 폴더에 있는 설계 입력 파일 csv 파일에 대상 시퀀스를 입력합니다. 설계 기능에 사용할 모수를 선택합니다. 설계 함수를 실행하여 관심 대상에 대한 토홀드 스위치 설계를 생성합니다.
완료되면 final_designs 폴더로 이동하여 csv 형식 스프레드시트에서 상단 토홀드 스위치 설계 시퀀스와 해당 대상 시퀀스를 찾습니다. 알고리즘에 의해 생성된 토홀드 스위치 DNA 서열이 5개의 프라임 말단에 T7 프로모터 서열을 포함하고 3개의 프라임 말단에 보존된 21개의 뉴클레오티드 링커 서열을 포함하는지 확인합니다. NCBI BLAST를 사용하여 서열 상동성을 검사하여 다른 일반적인 바이러스에 대해 상단 발가락 스위치 설계 시퀀스를 스크리닝합니다.
40% 미만의 혈액학을 가진 시퀀스를 허용합니다. 토홀드 스위치 헤어핀 DNA 올리고 및 역증폭 프라이머의 용액을 뉴클레아제가 없는 물에서 10마이크로몰 농도로 준비합니다. 이 표에 따라 얼음 위의 PCR 튜브에서 반응을 조립하십시오.
이 표에 나열된 사이클링 조건에 따라 반응 튜브를 열순환기에 놓습니다. 아가로스 겔에서 PCR 산물을 분석합니다. PCR 산물을 정제하고 충분히 높은 농도를 보장하기 위해 최소한의 뉴클레아제가 없는 물에서 DNA를 용리합니다.
분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량화합니다. 뉴클레아제가 없는 물 1밀리리터에 분말 25mg을 용해시켜 CPRG 스톡 용액을 준비합니다. 여기에 표시된 표준 프로토콜에 따라 얼음 위에 마스터 믹스를 준비하십시오.
무세포 마스터 믹스를 PCR 튜브에 분주합니다. 무세포 대조군 및 스위치 단독 대조군의 경우, 뉴클레아제가 없는 물을 5.94마이크로리터의 부피에 첨가하십시오. 그리고 반응을 위해 PCR 정제 된 토홀드 스위치 DNA를 추가하여 최종 농도 33 나노 몰을 얻습니다.
토홀드 스위치와 표적 RNA 조합을 테스트하려면 시험관내 전사된 표적 RNA를 1마이크로몰의 최종 농도로 추가합니다. 피펫팅과 원심분리기로 모든 반응을 완전히 혼합합니다. 바닥이 있는 검은색 투명 384웰 플레이트에 반응 웰을 둘러싼 웰에 30마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다.
그런 다음 2mm 생검 펀치와 핀셋을 사용하여 BSA 차단 여과지 디스크를 잘라 반응 웰에 넣습니다. 각 반응 튜브에서 1.8마이크로리터를 384웰 플레이트의 여과지 디스크에 삼중으로 분주합니다. 플레이트를 투명 PCR 필름으로 덮고 플레이트 리더에 넣습니다.
570 나노 미터에서 130 분 동안 매분 섭씨 37도에서 흡광도를 측정합니다. 뉴클레아제가 없는 물에서 모든 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 25 마이크로몰 스톡 용액을 준비합니다. 여기에 표시된 마스터 믹스를 사용하여 5마이크로리터 반응을 설정합니다.
흰색 침전물이 용해될 때까지 피펫팅하여 혼합한 다음 PCR 튜브에 분주합니다. 정방향 및 역방향 프라이머를 적절한 튜브에 추가한 다음 뉴클레아제가 없는 물 1마이크로리터 또는 표적 트리거 RNA의 피코몰 2개를 추가합니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하고 튜브를 짧게 회전시킵니다.
여기에 표시된 대로 열순환기에서 배양 프로토콜을 설정합니다. 12분 후, 튜브를 제거하고 각 튜브에 1.25마이크로리터의 효소 혼합물을 첨가한 다음, 혼합 및 원심분리한다. 섭씨 41도 유지 단계를 건너뛴 후 튜브를 열순환기로 되돌려 1시간 반응 배양을 시작합니다.
그런 다음 프라이머 성능을 평가하기 위해 종이 기반 무세포 토홀드 스위치 반응을 조합하고 데이터를 분석합니다. 민감도 분석을 위해 후보 프라이머 쌍을 식별하고 뉴클레아제가 없는 물에서 표적 RNA의 연속 희석을 준비합니다. NASBA 및 무세포 반응을 생물학적 삼중으로 선택된 프라이머 세트로 반복합니다.
추출된 환자 RNA 1마이크로리터를 사용하여 섹션 5와 같이 NASBA 증폭 및 종이 기반 무세포 반응을 수행합니다. 반응 후 384웰 반응 플레이트를 준비하고 섭씨 37도의 휴대용 플레이트 판독기에서 분석을 실행합니다. 그런 다음 RT-qPCR 구성 요소를 조립하고 이 표에 따라 시약을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.
피펫팅으로 반응물을 혼합합니다. 96웰 또는 384웰 PCR 플레이트의 각 웰에 6.5마이크로리터를 분주한 다음 각 RNA 주형을 3.5마이크로리터씩 삼중으로 분주합니다. 플레이트 위에 PCR 필름을 놓습니다.
384-웰 플레이트를 600배 G에서 2분 동안 원심분리한다. 플레이트를 RT-qPCR 기계에 놓고 여기에 표시된 대로 사이클링 조건을 실행합니다. 계산 설계에 따라 3개의 토홀드 스위치를 구성하고 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분석했습니다.
약 3, 000 개의 염기쌍 밴드가 성공적인 반응을 나타 냈습니다. 발가락 스위치를 각각의 시험관내 전사된 트리거 RNA에 대해 평가하였다. 3개의 센서 모두 흡광도의 증가를 나타냈지만, 센서(27B)는 가장 빠른 온 속도를 보인 반면, 스위치(33B, 47B)는 배경 활동을 나타내는 온/오프 비율이 낮고 특이성이 감소하였다.
570나노미터에서 흡광도의 배변화는 스위치(27B)가 온/오프 신호비에서 최고의 성능을 갖는다는 것을 보여주었다. 또한 NASBA와 결합하면 마이크로 리터당 124 분자의 낮은 농도에서 RNA를 검출 할 수있어 높은 감도를 나타냅니다. 브라질로부터의 지카 바이러스 환자 샘플을 휴대용 플레이트 리더를 사용하여 센서의 임상 진단 정확도를 평가하기 위해 시험하였다.
노란색에서 보라색으로의 색상 변화는 양성 샘플을 식별했습니다. 각 종이 기반 반응에 대한 비색 반응은 PLUM 휴대용 플레이트 리더의 통합 소프트웨어에 의해 시간이 지남에 따라 표시되었습니다. 임계 값을 초과 한 샘플은 양성으로 간주되었습니다.
센서의 임상 성능은 RT-qPCR과 비교하여 확립되었습니다. 샘플은 주기 임계값이 38 이하일 때 양성으로 간주되었습니다. 환자 시험을 진행하기 전에 토홀드 스위치 스크린과 NASBA 프라이머 감도의 결과를 재현 가능하고 최적화하는 것이 중요합니다.
단순성과 적응성을 감안할 때 여기에 설명된 진단 플랫폼은 특히 저소득 국가의 의료 시스템에 이점을 제공할 수 있는 새로운 현장 진료 도구 개발을 위한 길을 열었습니다.
