Nosso protocolo descreve o projeto, a montagem e a validação de diagnósticos baseados em circuitos genéticos. Esses diagnósticos moleculares baseados em papel são de baixo custo e sensíveis, sendo capazes de detectar concentrações clinicamente relevantes de ácidos nucleicos e podem ser projetados para detectar praticamente qualquer sequência. Esta é uma tecnologia de plataforma que pode ser projetada pelos usuários para suas necessidades e tem o potencial de trazer diagnósticos de nível clínico para configurações de recursos odontológicos mais descentralizadas.
O sensor de interruptor de retenção de dedo livre de células pode ser projetado para praticamente qualquer alvo à base de ácido nucleico. Trabalhos recentes demonstraram diagnósticos livres de células para Ebola, norovírus, SARS-CoV-2, C.difficile e bactérias causadoras de febre tifoide. Demonstrando o procedimento estarão Severino Jefferson Rivero da Silva, pós-doutorando, e Pouriya Bayat, doutoranda do meu laboratório.
Para projetar o interruptor de apoio ao dedo do pé, identifique as sequências-alvo do genoma do vírus Zika e escolha as sequências-alvo do vírus Zika a partir dos amplificadores, conforme descrito no protocolo de texto. Baixe o pacote de software de design do interruptor do dedo do pé. Abra o MATLAB e navegue até a pasta do software de design.
Insira as sequências de destino no arquivo csv do arquivo de entrada de design localizado na subpasta de entrada. Selecione os parâmetros a serem usados para a função de design. Execute a função de design para gerar os designs do interruptor de retenção para os alvos de interesse.
Após a conclusão, navegue até a pasta final_designs e localize as sequências de design do switch de dedo do pé superior e as sequências de destino correspondentes em planilhas no formato csv. Certifique-se de que as sequências de DNA de interruptor de dedo do pé geradas pelo algoritmo contenham as sequências promotoras T7 na extremidade cinco primos e uma sequência conservada de 21 ligadores de nucleotídeos nas três extremidades primos. Use o NCBI BLAST para filtrar as sequências de design do interruptor de dedo do pé superior em relação a outros vírus comuns, verificando a homologia de sequência.
Aceitar sequências com menos de 40% de hemologia. Preparar soluções dos oligos de DNA hairpin do interruptor do dedo do pé e iniciadores de amplificação reversa a uma concentração de 10 micromolares em água livre de nuclease. Monte as reações em tubos de PCR sobre gelo de acordo com esta tabela.
Coloque os tubos de reação em um termociclador, seguindo as condições de ciclagem listadas nesta tabela. Analise os produtos de PCR em um gel de agarose. Purificar os produtos de PCR e eluir o DNA em um volume mínimo de água livre de nuclease para garantir uma concentração suficientemente alta.
Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro. Prepare uma solução-mãe de CPRG dissolvendo 25 miligramas do pó em um mililitro de água livre de nuclease. Prepare uma mistura mestre no gelo de acordo com o protocolo padrão mostrado aqui.
Dispense a mistura mestra sem células em tubos de PCR. Para controles sem células e controles de interruptor sozinhos, adicione água livre de nuclease a um volume de 5,94 microlitros. E para a reação, adicione o DNA do interruptor de dedo do pé purificado por PCR para obter uma concentração final de 33 nanomolares.
Para testar o interruptor de apoio do dedo do pé e a combinação de RNA alvo, adicione o RNA-alvo transcrito in vitro a uma concentração final de um micromolar. Misture todas as reações completamente pipetando e centrifugando brevemente. Em uma placa de fundo claro preto de 384 poços, adicione 30 microlitros de água livre de nuclease aos poços que cercam os poços de reação.
Em seguida, usando um punção de biópsia de dois milímetros e uma pinça, corte os discos de papel de filtro bloqueados pela BSA e coloque-os nos poços de reação. Dispense 1,8 microlitros de cada tubo de reação nos discos de papel de filtro na placa de 384 poços em triplicado. Cubra a placa com filme de PCR transparente e coloque-a em um leitor de placas.
Meça a absorvância a 570 nanômetros a 37 graus Celsius a cada minuto por 130 minutos. Preparar uma solução-mãe de 25 micromolares de todos os conjuntos de primer para a frente e para trás em água isenta de nuclease. Configure uma reação de cinco microlitros usando a mistura mestre mostrada aqui.
Misture por pipetagem até que o precipitado branco solubilize e, em seguida, dispense em tubos de PCR. Adicione os primers para frente e para trás aos tubos apropriados, seguido pela adição de um microlitro de água livre de nuclease ou dois picomolares de RNA de gatilho alvo. Misture suavemente pipetando e gire brevemente os tubos.
Configure o protocolo de incubação em um termociclador, como mostrado aqui. Após 12 minutos, retire os tubos e adicione 1,25 microlitros da mistura enzimática a cada tubo, seguido de mistura e centrifugação. Devolva os tubos ao termociclador depois de pular a etapa de retenção de 41 graus Celsius para iniciar a incubação da reação de uma hora.
Em seguida, para avaliar o desempenho do primer, monte as reações de interruptor de dedo do pé sem células baseadas em papel e analise os dados. Para análise de sensibilidade, identifique pares de iniciadores candidatos e prepare diluições seriadas de RNA alvo em água livre de nuclease. Repita as reações NASBA e livre de células com os conjuntos de primer selecionados em triplicados biológicos.
Usando um microlitro de RNA extraído do paciente, execute a amplificação NASBA e as reações livres de células à base de papel, conforme mostrado na seção cinco. Após as reações, prepare a placa de reação de 384 poços e execute o ensaio em um leitor de placas portátil a 37 graus Celsius. Em seguida, monte os componentes RT-qPCR e adicione os reagentes a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro de acordo com esta tabela.
Misture a reação por pipetagem. Dispense 6,5 microlitros em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços ou 384 poços, seguida por 3,5 microlitros de cada molde de RNA em triplicado. Coloque um filme de PCR sobre a parte superior da placa.
Centrifugar a placa de 384 poços a 600 vezes G por dois minutos. Coloque a placa em uma máquina RT-qPCR e execute as condições de ciclismo, conforme mostrado aqui. Seguindo o delineamento computacional, três interruptores de dedo do pé foram construídos e analisados por eletroforese em gel de agarose.
Uma banda em torno de 3.000 pares de bases indicou uma reação bem-sucedida. Os interruptores de dedo do pé foram avaliados em relação ao respectivo RNA desencadeante transcrito in vitro. Enquanto todos os três sensores exibiram um aumento na absorvência, o sensor 27B teve a taxa mais rápida, enquanto os interruptores 33B e 47B tiveram uma menor relação liga/desliga, indicando atividade de fundo e especificidade reduzida.
A mudança de dobra de absorbância a 570 nanômetros mostrou que o interruptor 27B tem o melhor desempenho com uma relação de sinal on/off. Além disso, quando acoplado ao NASBA, ele pode detectar RNA em concentrações tão baixas quanto 124 moléculas por microlitro, indicando alta sensibilidade. Amostras de pacientes com o vírus Zika do Brasil foram testadas para avaliar a precisão diagnóstica clínica dos sensores usando um leitor de placas portátil.
Uma mudança de cor de amarelo para roxo identificou uma amostra positiva. A resposta colorimétrica para cada reação baseada em papel foi plotada ao longo do tempo pelo software integrado no leitor de placas portátil PLUM. As amostras que ultrapassaram o limiar foram consideradas positivas.
O desempenho clínico do sensor foi estabelecido por comparação com a RT-qPCR. As amostras foram consideradas positivas quando o valor do limiar do ciclo foi igual ou inferior a 38. É importante garantir que os resultados das telas de troca de dedo do pé e da sensibilidade do primer NASBA sejam reprodutíveis e otimizados antes de avançar com os ensaios com pacientes.
Dada a sua simplicidade e adaptabilidade, a plataforma diagnóstica aqui descrita abriu caminho para o desenvolvimento de novas ferramentas de ponto de atendimento que possam trazer benefícios para o sistema de saúde, especialmente para os países de baixa renda.
