Bu protokolde, elektrofizyolojik özellikleri incelemek için gerekli ilk adım olan saflaştırılmış, tam uzunlukta TRP kanalları elde etmek ve tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgilerini elde etmek için saflaştırma işlemini gösteriyoruz. INAD protein kompleksinin örnekleme mekanizmasına dayanarak ve çok daha yüksek kapasiteye sahip düşük maliyetli nikel boncuklar kullanılarak, sinek kafalarından yeterli miktarda TRP kanalı saflaştırılabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Yuyang Liu olacak.
Başlamak için, kalsiyum klorür ısı şoku dönüşüm yöntemini kullanarak pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 plazmidini E.coli BL21 hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniye 10 mililitre Luria Bertani ortamında aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyüyün. 10 mililitre tohumlama kültürünü bir litre Luria Bertani ortamına ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Hücrelerin optik yoğunluğu 0.5'e ulaştıktan sonra, hücreleri 16 santigrat dereceye kadar soğutun ve 0.1 milimolar izopropil-beta-D-1-tiyogalaktopiranosid ekleyin. Aşırı ekspresyondan sonra, santrifüjleme yoluyla bir litre kültürlenmiş hücreyi toplayın ve 40 mililitre fosfat tamponlu salin içinde yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri, dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş yüksek basınçlı homojenizatöre yükleyin.
Homojenizatör basıncını yavaşça 800 bar'a yükseltin. Giriş tırnağını açın ve yeniden askıya alınan hücrelerin dar yarıklı bir valften dairesel olarak geçmesine izin verin. Beş mililitre glutatyon boncuklarını bir yerçekimi akış kolonuna yükleyin ve boncukları toplam üç kez 50 mililitre fosfat tamponlu salin tamponu ile yıkayın.
Yüksek basınçlı homojenizatörden hücre lizatını 48, 384 kez G.Yerçekimi akış sütunundaki dengelenmiş glutatyon boncuklarına santrifüj edilmiş hücre lizatının süpernatanının yaklaşık 40 mililitresini ekleyin ve 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Glutatyon boncuklarını her 10 dakikada bir tekrar askıya alın. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış sekmesini açın.
Akış fraksiyonunu atın ve kalan glutatyon boncuklarını 50 mililitre fosfat tamponlu salin tamponu ile iki kez durulayın. Glutatyon boncuklarına 15 mililitre elüsyon tamponu ekleyin ve boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın. GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını 50 mL'lik bir konik tüpe boşaltın ve bir boyut hariç tutma sütununa yükleyin.
Tüp başına salınan proteinlerin beş mililitresini toplayın ve saflaştırılmış parçaları, soğutulmuş bir santrifüjdeki bir ultrafiltrasyon spin kolonunda santrifüjleme yoluyla bir mililitreye yoğunlaştırın. His etiketli NORPA 863-1095 parçasını saflaştırmak için, nikel boncukları kullanarak daha önce gösterilen prosedürü izleyin. Yetişkin sinekleri 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerinde toplayın ve 10 dakika boyunca sıvı azotta dondurun.
Dondurulmuş tüpleri elle kuvvetlice sallayın ve karışımı üç, sıralı olarak istiflenmiş, önceden soğutulmuş paslanmaz çelik eleklere aktarın. Elekleri sallayın ve sinek kafalarını bir fırça kullanarak 40 örgülü elek üzerinden süpürün. Onları beş mililitrelik konik tüplere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Önceden soğutulmuş bir harç ve havane kullanarak sıvı azotta 0,5 gram kafayı homojenize edin. Homojenize edilmiş kafaları beş mililitre 10X lizis tamponunda çözün, ardından 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 20, 817 kez G'de santrifüjleme yapın. Spin down süpernatant, 60 dakika boyunca dört santigrat derecede 100.000 kez G'yi daha da santrifüj eder.
Yerçekimi akış kolonuna bir mililitre nikel boncuk ekleyin ve boncukları dört santigrat derecede 10 mililitre çift damıtılmış su ile üç kez yıkayın. Boncukları, dört santigrat derecede üç kez 10 sütun hacimli lizis tamponu ile dengeleyin. Nikel kolonuna 500 mikrolitre 600 mikromolar saflaştırılmış His-etiketli NORPA 863-1095 proteini ekleyin ve sütunu inkübe edin.
Boncukları her 10 dakikada bir askıya alın. Boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için kolon çıkış musluğunu açın ve nikel boncukları 10 mililitre soğuk lizis tamponu ile yıkayın. Daha sonra, nikel kolonuna Drosophila kafa homojenatının soğuk süpernatantını ekleyin.
Kuluçkadan sonra, boncukları 10 mililitre lizis tamponu ile yıkayın ve boncuklara 500 mikrolitre 600 mikromolar GST etiketli TRP 1261-1275 protein ekleyin. Yerçekimi sütunundan salınan fraksiyonu toplayın. Nikel boncukları 10 mililitre bağlayıcı tamponla yıkayın.
Ardından, elüsyon tamponu ekleyin ve yerçekimi akış sütunundan elüsyon fraksiyonunu toplayın. Drosophila TRP kanal saflaştırmasından salınan fraksiyonları, dört mililitrelik bir ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak konsantre edin. Numuneyi boyut hariç tutma sütununa enjekte edin ve proteinleri makul bir akış hızıyla süzün.
GST etiketli TRP 1261-1275 fragmanı E.coli hücrelerinde eksprese edildi ve glutatyon boncukları ve bir boyut dışlama sütunu kullanılarak saflaştırıldı. Benzer şekilde, His-etiketli NORPA 863-1095 parçası, nikel boncuklar ve boyut hariç tutma sütunu kullanılarak ifade edildi ve saflaştırıldı. Salınımlı TRP kanalı, aşırı GST etiketli TRP 1261-1275 peptidinden, boyut hariç tutma kromatografisi ile ayrılır.
Bir yan ürün olarak, INAD, ePKC, NORPA 863-1095 kompleksleri TRP 1261-1275 peptid yarışmasından sonra elde edilir. Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, sinek kafalarını sıvı azotta homojenize etmek ve homojenatı DDM adı verilen bir deterjan içeren tamponda çözmektir. Bu prosedürü takiben, montaj ve düzenleme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilecek tüm INAD protein kompleksini de saflaştırabiliriz.
Bu yöntemin gelecekteki potansiyel bir uygulaması, Cryo-EM tekniklerini kullanarak endojen Drosophila TRP kanalının yapısal bilgilerini incelemek olacaktır. Ek olarak, yapay çift katmanlı lipit membranındaki saflaştırılmış endojen Drosophila TRP kanallarının elektrofizyolojik özelliklerinin ölçülmesi de mümkündür.
