في هذا البروتوكول ، نوضح عملية التنقية للحصول على قنوات TRP منقية وكاملة الطول ، وهي الخطوة الأولى الضرورية لدراسة الخصائص الكهروفسيولوجية ، والحصول على معلومات هيكلية لقناة Drosophila TRP كاملة الطول. استنادا إلى آلية أخذ العينات من مركب البروتين INAD واستخدام حبات النيكل منخفضة التكلفة ذات السعة الأعلى بكثير ، يمكن تنقية كمية كافية من قنوات TRP من رؤوس الذبابة. سيوضح الإجراء يويانغ ليو ، وهو فني من مختبرنا.
للبدء ، قم بتحويل بلازميد pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 إلى خلايا E.coli BL21 ، باستخدام طريقة تحويل الصدمة الحرارية لكلوريد الكالسيوم. تطعيم مستعمرة واحدة في 10 ملليلتر من وسط لوريا بيرتاني ، وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. أضف 10 ملليلترات من ثقافة البذر إلى لتر واحد من وسط لوريا بيرتاني واحتضنها عند 37 درجة مئوية.
بعد أن تصل الكثافة البصرية للخلايا إلى 0.5 ، قم بتبريد الخلايا إلى 16 درجة مئوية ، وأضف 0.1 ملليمولار أيزوبروبيل بيتا D-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيد. بعد الإفراط في التعبير ، قم بتكوير لتر واحد من الخلايا المستزرعة عن طريق الطرد المركزي ، وأعد التعليق في 40 ملليلتر من المياه المالحة العازلة بالفوسفات. قم بتحميل الخلايا المعاد تعليقها في مجانس عالي الضغط ، يتم تبريده مسبقا إلى أربع درجات مئوية.
زيادة ضغط المجانس ببطء إلى 800 بار. افتح علامة تبويب المدخل واسمح للخلايا المعاد تعليقها بالمرور بشكل دائري عبر صمام ذي شقوق ضيقة. قم بتحميل خمسة ملليلترات من حبات الجلوتاثيون في عمود تدفق الجاذبية ، واغسل الخرز ب 50 ملليلتر من المخزن الملحي المخزن بالفوسفات ، لما مجموعه ثلاث مرات.
الطرد المركزي للخلية محللة من مجانس الضغط العالي في 48،384 مرة G.أضف حوالي 40 ملليلتر من supernatant من محللات الخلية بالطرد المركزي إلى حبات الجلوتاثيون المتوازنة في عمود تدفق الجاذبية ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبات الجلوتاثيون كل 10 دقائق. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، افتح علامة تبويب مخرج العمود لفصل الخرز وجزء التدفق.
تخلص من الجزء المتدفق ، واشطف حبات الجلوتاثيون المتبقية مرتين ، مع 50 ملليلتر من المخزن الملحي المخزن بالفوسفات. أضف 15 ملليلتر من المخزن المؤقت إلى حبات الجلوتاثيون ، وأعد تعليق الخرز كل 10 دقائق. قم بإلغاء جزء TRP 1261-1275 الموسوم ب GST في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وقم بتحميله في عمود استبعاد الحجم.
جمع خمسة ملليلترات من البروتينات المطفأة لكل أنبوب، وتركيز الشظايا النقية إلى ملليلتر واحد عن طريق الطرد المركزي في عمود دوران الترشيح الفائق في جهاز طرد مركزي مبرد. لتنقية جزء NORPA 863-1095 الموسوم به، اتبع الإجراء الموضح سابقا باستخدام حبات النيكل. جمع الذباب البالغ في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 ملليلتر ، وتجميدها في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق.
هز الأنابيب المجمدة بقوة باليد وانقل الخليط إلى ثلاثة غربالات من الفولاذ المقاوم للصدأ مكدسة بالتتابع ومبردة مسبقا. هز المناخل ، واكنس رؤوس الذبابة من المنخل الشبكي 40 باستخدام فرشاة. انقلها إلى خمسة أنابيب مخروطية ملليلتر وخزنها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
تجانس 0.5 غرام من الرؤوس في النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة مبردة مسبقا. قم بإذابة الرؤوس المتجانسة في خمسة ملليلتر من مخزن التحلل العازل 10X ، يليه الطرد المركزي عند 20،817 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. يتم طرد السوبرنات المغزلي لأسفل بشكل أكبر 100،000 مرة من G عند أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة.
أضف ملليلتر واحد من حبات النيكل إلى عمود تدفق الجاذبية ، واغسل الخرز ثلاث مرات ب 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج عند أربع درجات مئوية. قم بموازنة الخرز مع 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتحلل ، ثلاث مرات عند أربع درجات مئوية. أضف 500 ميكرولتر من 600 ميكرومولار منقى بروتين NORPA 863-1095 الموسوم إلى عمود النيكل ، واحتضن العمود.
أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق. افتح صنبور مخرج العمود لفصل الخرز وجزء التدفق ، واغسل حبات النيكل ب 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل البارد. ثم ، أضف supernatant الباردة من ذبابة الفاكهة رأس متجانسة في عمود النيكل.
بعد الحضانة ، اغسل الخرز ب 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل وأضف 500 ميكرولتر من 600 بروتين TRP 1261-1275 المولى الحاصل على ضريبة السلع والخدمات في الخرز. اجمع الكسر المقطوع من عمود الجاذبية. اغسل حبات النيكل ب 10 ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم.
ثم ، أضف المخزن المؤقت للإزالة وجمع جزء الاستخلاص من عمود تدفق الجاذبية. ركز الكسور المستخلصة من تنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP ، باستخدام عمود دوران فائق الترشيح بأربعة ملليلترات. حقن العينة في عمود استبعاد الحجم ، وتخلص من البروتينات بمعدل تدفق معقول.
تم التعبير عن جزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات في خلايا E.coli وتم تنقيته باستخدام حبات الجلوتاثيون وعمود استبعاد الحجم. وبالمثل ، تم التعبير عن جزء NORPA 863-1095 الموسوم به وتنقيته باستخدام حبات النيكل وعمود استبعاد الحجم. يتم فصل قناة TRP المقطوعة عن الببتيد TRP 1261-1275 المفرط الموسوم ب GST ، حسب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.
كمنتج ثانوي ، يتم الحصول على مجمعات INAD و ePKC و NORPA 863-1095 بعد منافسة الببتيد TRP 1261-1275. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا البروتوكول ، هو تجانس رؤوس الذباب في النيتروجين السائل وحل التجانس في المخزن المؤقت الذي يحتوي على منظف يسمى DDM. بعد هذا الإجراء ، يمكننا أيضا تنقية مركب بروتين INAD بأكمله والذي يمكن استخدامه لدراسة آليات التجميع والتنظيم.
سيكون التطبيق المستقبلي المحتمل لهذه الطريقة هو دراسة المعلومات الهيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP الداخلية باستخدام تقنيات Cryo-EM. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قياس الخصائص الكهروفسيولوجية لقنوات ذبابة الفاكهة TRP الداخلية المنقاة في غشاء دهني اصطناعي ثنائي الطبقة أمر ممكن أيضا.
