In diesem Protokoll demonstrieren wir den Reinigungsprozess zur Gewinnung gereinigter TRP-Kanäle in voller Länge, was der notwendige erste Schritt ist, um elektrophysiologische Eigenschaften zu untersuchen und strukturelle Informationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge zu erhalten. Basierend auf dem Probenahmemechanismus des INAD-Proteinkomplexes und unter Verwendung kostengünstiger Nickelkügelchen mit viel höherer Kapazität kann eine ausreichende Menge an TRP-Kanälen aus Fliegenköpfen gereinigt werden. Yuyang Liu, ein Techniker aus unserem Labor, wird das Verfahren demonstrieren.
Wandeln Sie zunächst das pGEX 4T-1 TRP 1261-1265-Plasmid in E.coli BL21-Zellen um, indem Sie die Calciumchlorid-Hitzeschock-Transformationsmethode verwenden. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 Milliliter Luria Bertani Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Die 10 Milliliter Aussaatkultur in einen Liter Luria Bertani Medium geben und bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nachdem die optische Dichte der Zellen 0,5 erreicht hat, kühlen Sie die Zellen auf 16 Grad Celsius ab und fügen Sie 0,1 millimolar Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranosid hinzu. Nach der Überexpression einen Liter kultivierte Zellen durch Zentrifugation pelletieren und in 40 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendieren. Laden Sie die resuspendierten Zellen in einen auf vier Grad Celsius vorgekühlten Hochdruckhomogenisator.
Erhöhen Sie den Homogenisatordruck langsam auf 800 bar. Öffnen Sie die Einlasslasche und lassen Sie die resuspendierten Zellen kreisförmig durch ein Ventil mit schmalen Schlitzen gehen. Laden Sie fünf Milliliter Glutathionperlen in eine Schwerkraftflusssäule und waschen Sie die Perlen mit 50 Millilitern phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer insgesamt dreimal.
Zelllysat aus dem Hochdruckhomogenisator bei 48, 384 mal G zentrifugieren.Etwa 40 Milliliter des Überstands des zentrifugierten Zelllysats zu den ausgleichenden Glutathionperlen in der Schwerkraftsäule geben und 30 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren. Suspendieren Sie die Glutathionperlen alle 10 Minuten. Öffnen Sie nach 30 Minuten Inkubation die Säulenauslassregisterkarte, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen.
Verwerfen Sie die Durchflussfraktion und spülen Sie die verbleibenden Glutathionperlen zweimal mit 50 Millilitern phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer ab. Fügen Sie 15 Milliliter Elutionspuffer zu den Glutathionperlen hinzu und suspendieren Sie die Perlen alle 10 Minuten. Eluieren Sie das GST-getaggte TRP 1261-1275-Fragment in ein konisches 50-ml-Rohr und laden Sie es in eine Größenausschlusssäule.
Sammeln Sie fünf Milliliter der eluierten Proteine pro Röhrchen und konzentrieren Sie die gereinigten Fragmente durch Zentrifugation in einer Ultrafiltrationsspinsäule in einer gekühlten Zentrifuge auf einen Milliliter. Um das mit His gekennzeichnete NORPA 863-1095-Fragment zu reinigen, befolgen Sie das zuvor demonstrierte Verfahren mit Nickelperlen. Sammeln Sie erwachsene Fliegen in konischen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und frieren Sie sie 10 Minuten lang in flüssigem Stickstoff ein.
Schütteln Sie die gefrorenen Röhrchen kräftig von Hand und geben Sie die Mischung auf drei nacheinander gestapelte, vorgekühlte Edelstahlsiebe. Schütteln Sie die Siebe und fegen Sie die Fliegenköpfe mit einer Bürste vom 40-Mesh-Sieb. Überführen Sie sie in fünf Milliliter konische Röhrchen und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.
Homogenisieren Sie 0,5 Gramm Köpfe in flüssigem Stickstoff mit einem vorgekühlten Mörser und Stößel. Lösen Sie die homogenisierten Köpfe in fünf Milliliter 10-fachen Lysepuffers auf, gefolgt von einer Zentrifugation bei 20, 817 mal G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Der Spin-Down-Überstand wird 60 Minuten lang 100.000 mal G bei vier Grad Celsius weiter zentrifugiert.
Fügen Sie einen Milliliter Nickelperlen in die Schwerkraftflusssäule hinzu und waschen Sie die Perlen dreimal mit 10 Millilitern doppelt destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius. Gleichen Sie die Perlen mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer aus, dreimal bei vier Grad Celsius. Fügen Sie 500 Mikroliter 600 mikromolar gereinigtes His-markiertes NORPA 863-1095-Protein in die Nickelsäule hinzu und inkubieren Sie die Säule.
Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten aus. Öffnen Sie den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen, und waschen Sie die Nickelperlen mit 10 Millilitern kaltem Lysepuffer. Dann fügen Sie einen kalten Überstand des Drosophila-Kopfhomogenats in die Nickelsäule hinzu.
Nach der Inkubation waschen Sie die Perlen mit 10 Milliliter Lysepuffer und fügen Sie 500 Mikroliter 600 mikromolar GST-markiertes TRP 1261-1275-Protein in die Perlen hinzu. Sammeln Sie den eluierten Anteil aus der Schwerkraftsäule. Waschen Sie die Nickelperlen mit 10 Millilitern Bindepuffer.
Fügen Sie dann einen Elutionspuffer hinzu und sammeln Sie den Elutionsanteil aus der Schwerkraftflusssäule. Konzentrieren Sie die aus der Drosophila TRP-Kanalreinigung eluierten Fraktionen mit einer Vier-Milliliter-Ultrafiltrationsspinsäule. Injizieren Sie die Probe in die Größenausschlussspalte und eluieren Sie die Proteine mit einer angemessenen Durchflussrate.
Das mit GST gekennzeichnete TRP 1261-1275-Fragment wurde in E.coli-Zellen exprimiert und mit Glutathionperlen und einer Größenausschlusssäule gereinigt. In ähnlicher Weise wurde das mit His markierte NORPA 863-1095-Fragment mit Nickelperlen und Größenausschlusssäule exprimiert und gereinigt. Der eluierte TRP-Kanal ist durch Größenausschlusschromatographie vom übermäßigen GST-markierten TRP 1261-1275-Peptid getrennt.
Als Nebenprodukt werden die INAD-, ePKC- und NORPA 863-1095-Komplexe nach TRP 1261-1275-Peptidkonkurrenz erhalten. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist, die Fliegenköpfe in flüssigem Stickstoff zu homogenisieren und das Homogenat in einem Puffer aufzulösen, der ein Reinigungsmittel namens DDM enthält. Nach diesem Verfahren können wir auch den gesamten INAD-Proteinkomplex reinigen, mit dem seine Montage- und Regulationsmechanismen untersucht werden können.
Eine mögliche zukünftige Anwendung dieser Methode wird darin bestehen, die Strukturinformation des endogenen Drosophila-TRP-Kanals unter Verwendung von Kryo-EM-Techniken zu untersuchen. Darüber hinaus ist auch die Messung der elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigten endogenen Drosophila TRP-Kanälen in künstlicher Doppelschichtlipidmembran möglich.
