בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את תהליך הטיהור כדי להשיג תעלות TRP מטוהרות באורך מלא, שהוא הצעד הראשון ההכרחי לחקר תכונות אלקטרופיזיולוגיות, ולקבל מידע מבני של ערוץ ה- Drosophila TRP באורך מלא. בהתבסס על מנגנון הדגימה של קומפלקס החלבון INAD ושימוש בחרוזי ניקל בעלות נמוכה עם קיבולת גבוהה בהרבה, ניתן לטהר כמות מספקת של תעלות TRP מראשי זבובים. מי שידגים את ההליך יהיה יו-יאנג ליו, טכנאי מהמעבדה שלנו.
כדי להתחיל, להפוך את pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 פלסמיד לתאי E.coli BL21, באמצעות שיטת התמרת הלם חום סידן כלוריד. לחסן מושבה אחת ב 10 מיליליטרים של מדיום לוריא ברטאני, ולגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו את 10 המיליליטרים של תרבות הזריעה לליטר אחד של מדיום לוריא ברטאני ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר שהצפיפות האופטית של התאים מגיעה ל-0.5, קררו את התאים ל-16 מעלות צלזיוס, והוסיפו 0.1 מילימולר איזופרופיל-בטא-D-1-תיוגאלאקטופירנוזיד. לאחר הבעת יתר, גלולה ליטר אחד של תאים בתרבית על ידי צנטריפוגה, ו resuspend ב 40 מיליליטר של מלוחים חצוצר פוספט. טען את התאים ההזויים לתוך הומוגנייזר בלחץ גבוה, מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס.
לאט לאט להגדיל את לחץ הומוגנייזר ל 800 בר. פתח את לשונית הכניסה ותן לתאים המוחזרים לעבור באופן מעגלי דרך שסתום עם חריצים צרים. טענו חמישה מיליליטרים של חרוזי גלוטתיון לעמוד זרימת כבידה, ושטפו את החרוזים ב-50 מיליליטרים של חיץ מלוחים בעל מאגר מלוחים בעל מאגרי פוספט, בסך הכל שלוש פעמים.
צנטריפוגה התא ליזט מההומוגנייזר בלחץ גבוה ב-48, 384 פעמים G.הוסף כ-40 מיליליטרים של הסופרנאטנט של התא הצנטריפוגי ליאזט לחרוזי הגלוטתיון המשוזבים בעמוד זרימת הכבידה, ודגירה במשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בצעו החייאה של חרוזי הגלוטתיון כל 10 דקות. לאחר 30 דקות של דגירה, פתח את לשונית יציאת העמודה כדי להפריד בין החרוזים לשבר הזרימה.
השליכו את השבר העובר דרך הזרימה, ושטפו פעמיים את חרוזי הגלוטתיון הנותרים, עם 50 מיליליטרים של חיץ מלוחים בעל מאגרי פוספטים. מוסיפים 15 מיליליטרים של חיץ אלוטיון לחרוזי הגלוטתיון, ומחזירים את החרוזים כל 10 דקות. אלחזרו את שבר TRP 1261-1275 המתויג ב-GST לצינור חרוטי של 50 מ"ל, וטענו אותו לעמודת אי-הכללת גודל.
אספו חמישה מיליליטרים של החלבונים המבוקרים לכל צינור, ותרכזו את השברים המטוהרים למיליליטר אחד על ידי צנטריפוגה בעמודת ספין אולטרה-סינון בצנטריפוגה מקוררת. כדי לטהר את קטע NORPA 863-1095 המתויג שלו, בצע את הנוהל שהודגם בעבר באמצעות חרוזי ניקל. אספו זבובים בוגרים בצינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מיליליטר, והקפיאו אותם בחנקן נוזלי למשך 10 דקות.
לנער במרץ את הצינורות הקפואים ביד ולהעביר את התערובת לשלוש מסננות נירוסטה, שנערמו ברצף, מקוררות מראש. מנענעים את המסננות, ומטאטאים את ראשי הזבובים מהמסננת בת 40 הרשת באמצעות מברשת. מעבירים אותם לחמישה צינורות חרוטיים מיליליטר ומאחסנים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.
הומוגניזציה של 0.5 גרם ראשים בחנקן נוזלי באמצעות טיט מקורר מראש ומזיק. ממיסים את הראשים ההומוגניים בחמישה מיליליטרים של חיץ ליזיס 10X, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-20, 817 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסופרנטנט הסיבובי הוא צנטריפוגה נוספת 100, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
מוסיפים מיליליטר אחד של חרוזי ניקל לעמוד זרימת הכבידה, ושוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים בארבע מעלות צלזיוס. שיווי משקל את החרוזים עם 10 כרכים טורים של מאגר ליזיס, שלוש פעמים בארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של 600 מיקרומולרים שטוהרו על ידי חלבון NORPA 863-1095 המתויג שלו לעמודת הניקל, והדגמו את העמודה.
בצעו החייאה של החרוזים כל 10 דקות. פתחו את ברז היציאה של העמודה כדי להפריד בין החרוזים לשבר הזרימה, ושטפו את חרוזי הניקל ב-10 מיליליטרים של חיץ ליזיס קר. לאחר מכן, הוסיפו סופרנאטנט קר של ראש דרוזופילה הומוגנט לעמוד הניקל.
לאחר הדגירה, לשטוף את החרוזים עם 10 מיליליטרים של מאגר lysis ולהוסיף 500 microliters של 600 מיקרומולר GST מתויג TRP 1261-1275 חלבון לתוך החרוזים. לאסוף את השבר הסמוי מעמודת הכבידה. לשטוף את חרוזי ניקל עם 10 מיליליטר של חיץ מחייב.
לאחר מכן, הוסף חיץ אלוטיון ואסוף את שבר האלוטיון מעמודת זרימת הכבידה. רכז את השברים שהתחמקו מטיהור תעלות TRP של Drosophila, באמצעות עמודת ספין אולטרה-סינון של ארבעה מיליליטר. הזריקו את הדגימה לעמודת אי-הכללת הגודל, והוסיפו לחלבונים קצב זרימה סביר.
מקטע TRP 1261-1275 המתויג ב-GST התבטא בתאי E.coli וטוהר באמצעות חרוזי גלוטתיון ועמודת הרחקת גודל. באופן דומה, הקטע NORPA 863-1095 המתויג שלו הובטא וטוהר באמצעות חרוזי ניקל ועמודת הרחקת גודל. תעלת ה-TRP המרופטת מופרדת מהפפטיד TRP 1261-1275 המתויג יתר על המידה ב-GST, על ידי כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל.
כתוצר לוואי, קומפלקסים INAD, ePKC, NORPA 863-1095 מתקבלים לאחר תחרות פפטידים TRP 1261-1275. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים את הפרוטוקול הזה, הוא הומוגניזציה של ראשי הזבובים בחנקן נוזלי ולפתור את ההומוגנט בחיץ המכיל חומר ניקוי בשם DDM. בעקבות הליך זה, אנו יכולים גם לטהר את כל קומפלקס החלבון INAD אשר ניתן להשתמש בו כדי לחקור את מנגנוני ההרכבה והוויסות שלו.
יישום עתידי פוטנציאלי של שיטה זו יהיה ללמוד את המידע המבני של ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila באמצעות טכניקות Cryo-EM. בנוסף, מדידת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלות TRP דרוזופילה אנדוגניות מטוהרות בקרום שומנים דו-שכבתי מלאכותי אפשרי גם כן.
