В этом протоколе мы демонстрируем процесс очистки для получения очищенных, полноразмерных каналов TRP, что является необходимым первым шагом для изучения электрофизиологических свойств, и получения структурной информации о полноразмерном канале Drosophila TRP. Основываясь на механизме отбора проб белкового комплекса INAD и используя недорогие никелевые шарики с гораздо более высокой емкостью, достаточное количество каналов TRP может быть очищено от мучных головок. Демонстрировать процедуру будет Юян Лю, техник из нашей лаборатории.
Для начала преобразуйте плазмиду pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 в клетки E.coli BL21, используя метод преобразования теплового шока хлорида кальция. Инокулируют одну колонию в 10 миллилитрах среды Лурия Бертани и растут ночью при 37 градусах Цельсия. Добавьте 10 миллилитров посевной культуры в один литр среды Luria Bertani и инкубируйте при 37 градусах Цельсия.
После того, как оптическая плотность клеток достигнет 0,5, охладите клетки до 16 градусов Цельсия и добавьте 0,1 миллимоляра изопропил-бета-D-1-тиогалактопиранозида. После сверхэкспрессии гранулируют один литр культивируемых клеток центрифугированием и повторно суспендируют в 40 миллилитрах фосфатно-буферного физиологического раствора. Загрузите повторно суспендированные ячейки в гомогенизатор высокого давления, предварительно охлажденный до четырех градусов Цельсия.
Медленно увеличьте давление гомогенизатора до 800 бар. Откройте входную вкладку и позвольте повторно суспендированным ячейкам циркулярно пройти через клапан с узкими щелями. Загрузите пять миллилитров шариков глутатиона в столб самотечного потока и промыть шарики 50 миллилитрами фосфатно-буферного солевого буфера, в общей сложности три раза.
Центрифугируйте лизат клеток из гомогенизатора высокого давления в 48, 384 раза больше G.Добавьте около 40 миллилитров супернатанта центрифугированного лизата ячейки к уравновешенным шарикам глутатиона в колонке гравитационного потока и инкубируйте в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия. Повторно суспендируйте бусины глутатиона каждые 10 минут. После 30 минут инкубации откройте выходную вкладку колонны, чтобы отделить шарики и проточную фракцию.
Отбросьте проточную фракцию и дважды промойте оставшиеся шарики глутатиона 50 миллилитрами фосфатно-буферного солевого буфера. Добавьте 15 миллилитров буфера элюирования в бусины глутатиона и повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут. Элюируйте фрагмент TRP 1261-1275 с маркировкой GST в коническую трубку объемом 50 мл и загрузите его в колонку исключения размера.
Соберите пять миллилитров элюированных белков на пробирку и сконцентрируйте очищенные фрагменты до одного миллилитра путем центрифугирования в ультрафильтрационной спиновой колонне в охлажденной центрифуге. Чтобы очистить помеченный His-меткой фрагмент NORPA 863-1095, следуйте ранее продемонстрированной процедуре с использованием никелевых шариков. Соберите взрослых мух в 50-миллилитровые конические центрифужные трубки и заморозьте их в жидком азоте на 10 минут.
Энергично встряхните замороженные трубки вручную и переложите смесь на три последовательно уложенных, предварительно охлажденных сита из нержавеющей стали. Встряхните сита и смахните головки мух с 40-сетчатого сита с помощью щетки. Переложите их в пять миллилитровых конических трубок и храните при минус 80 градусах Цельсия.
Гомогенизировать 0,5 г головок в жидком азоте с помощью предварительно охлажденной ступки и пестика. Растворите гомогенизированные головки в пяти миллилитрах буфера лизиса 10X с последующим центрифугированием при 20, 817 G при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Спин-нисходящий супернатант дополнительно центрифугируется в 100 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 60 минут.
Добавьте один миллилитр никелевых шариков в столб гравитационного потока и трижды вымойте бусины 10 миллилитрами двойной дистиллированной воды при четырех градусах Цельсия. Уравновесьте бусины с 10 колонными объемами лизисного буфера, три раза при четырех градусах Цельсия. Добавьте 500 микролитров 600 микромолярного очищенного белка NORPA 863-1095 в никелевую колонку и инкубируйте колонку.
Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут. Откройте выходной кран колонны, чтобы отделить шарики и проточную фракцию, и промыть никелевые шарики 10 миллилитрами буфера холодного лизиса. Затем добавьте холодный супернатант гомогената головки дрозофилы в никелевую колонку.
После инкубации промыть шарики 10 миллилитрами лизисного буфера и добавить в шарики 500 микролитров 600 микромолярного белка TRP 1261-1275 с меткой GST. Соберите элюированную фракцию из гравитационного столба. Вымойте никелевые шарики 10 миллилитрами связывающего буфера.
Затем добавьте буфер элюирования и соберите фракцию элюирования из колонки гравитационного потока. Концентрируйте фракции, элюированные из очистки канала Drosophila TRP, используя четырехмиллилитровую ультрафильтрационную спиновую колонну. Введите образец в столбец исключения размера и элюируйте белки с разумной скоростью потока.
Помеченный GST фрагмент TRP 1261-1275 экспрессировали в клетках E.coli и очищали с помощью глутатионовых шариков и колонки исключения размера. Аналогичным образом, помеченный His фрагмент NORPA 863-1095 был выражен и очищен с использованием никелевых шариков и колонки исключения размера. Элюированный канал TRP отделяется от избыточного пептида TRP 1261-1275 с маркировкой GST, путем хроматографии исключения размера.
В качестве побочного продукта комплексы INAD, ePKC, NORPA 863-1095 получают после конкуренции пептидов TRP 1261-1275. Самое важное, что нужно помнить при попытке этого протокола, это гомогенизировать головки мух в жидком азоте и разрешать гомогенат в буфере, содержащем моющее средство под названием DDM. Следуя этой процедуре, мы также можем очистить весь белковый комплекс INAD, который может быть использован для изучения механизмов его сборки и регуляции.
Потенциальным будущим применением этого метода будет изучение структурной информации эндогенного канала Drosophila TRP с использованием методов Cryo-EM. Кроме того, возможно измерение электрофизиологических свойств очищенных эндогенных каналов Drosophila TRP в искусственной двухслойной липидной мембране.
