Este trabajo fue apoyado por el NIH / NHLBI subvención R01 HL082689 a Scott I. Simon y Anthony G. Passerini.

1. Cultivo de células y Preparación del substrato <ol><li> Cortar 3-pulgadas sustratos circulares de un 100 x 20 mm plato de cultivo de tejidos (BD Falcon), utilizando un torno. Esterilizar sustratos por inmersión en etanol al 70%. Colocar en un plato de Petri y la capa con 4 ml de colágeno de tipo I (100 ug / ml) durante 1 hora a temperatura ambiente, luego enjuague con 4 ml de PBS 1 x. </li><li> Suspender Humanos células endoteliales aórticas (AHCE, paso 4-6) en 6.5x10 5 células / ml y de las semillas mediante la aplicación de 1 ml directamente sobre el sustrato. Colocar en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora y permitir que las células se adhieren al sustrato durante 1 hora. </li><li> Añadir 9 ml de medio de crecimiento endotelial-2 (MEG-2) suplementado con 1x antibiótico-antimicótico solución a las células. Cambiar los medios de comunicación cada 2 días hasta que las células alcanzan el 90% de confluencia. </li><li> Mantener células THP-1 en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% y solución 1x antibiótico-antimicótico. Pasaje de las células cuando llegan a una densidad de 10 6 células / ml. </li></ol> 2. Protocolo de la célula Shearing Las células son acondicionados en una costumbre de cono y placa de dispositivo de cizallamiento de la célula (CSD). Detalles de dispositivos y especificaciones de diseño se documentan en la Tabla 1 y Figura 4. <ol><li> Preparar la CDS. Esterilizar la carcasa de una cámara con etanol y enjuagar con PBS estéril. Se calienta la vivienda a 37 ° C y nivel para asegurar que el cono es perpendicular a la monocapa de células. Montar el substrato con las células de la parte inferior de la carcasa y establecer el cono a la altura deseada. </li><li> Utilizar Leibovitz-15 (L-15) medio suplementado con BulletKit endotelial como el medio de cizallamiento para mantener el pH apropiado en ausencia de CO 2. Para estimular la inflamación, añadir factor de necrosis tumoral α (TNF-α, 0,5 ng / ml) al medio de cizallamiento e inyectar 6 ml en el dispositivo a través de una jeringa conectada a un puerto de entrada, teniendo cuidado de no introducir aireburbujas en la cámara. </li><li> Las células de corte en un esfuerzo de cizalla de magnitud constante (HSS, 15 dinas / cm 2) o un esfuerzo cortante oscilatorio (OSS, 0 ± 5 dinas / cm 2, 1 Hz) durante 4 horas. La SS deseado se consigue mediante la rotación del cono por encima de las células, que se controla con precisión con un motor de micro-paso a paso como se describió anteriormente 6 La SS pared en la superficie (τ w) se aproxima por.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="Ecuación 1" /> donde μ es la viscosidad del medio, ω es la velocidad angular del cono, y α es el ángulo de cono (0,5 °). La alineación de cono con el substrato se ajusta dentro de 0,05 ° a través de nivelación de precisión y la altura hueco fijado en 20 ± 10 micras utilizando un medidor de profundidad para minimizar la variación circunferencial y radial en τ w. El dispositivo ha sido validada para garantizar las características de flujo laminar. Quite la canas desde el dispositivo y preparar un análisis de la adhesión de los monocitos. </li></ol> 3. Fabricación de PDMS de microfluidos Cámara <ol><li> Obtener el molde maestro para el número deseado y la altura de canal de microfluidos del canal dependiendo de la aplicación. Las características del diseño específico utilizado en este protocolo se detallan en la Tabla 1. El método para la creación de estos ya está bien documentado en la literatura. 1 Brevemente, la red de canales está diseñado utilizando software CAD (Autodesk Inventor) y se imprimen en 5000 dpi en una transparencia. Fotorresistencia negativa (SU8) se hace girar sobre una oblea de silicio a un espesor de 100 micras. La transparencia se superpone y se expone a luz ultravioleta. No polimerizado fotorresistente se elimina la generación de la maestra réplica positiva. </li><li> Para preparar una solución de PDMS mezcla base de silicona con silicona agente de curado de 10:1 en peso en un barco de pesar y mezclar con una pipeta serológica de 5 ml. Tenga cuidado de no raspar las paredesdel pesaje barco para evitar la adición de escamas de plástico a la solución. </li><li> Coloque las tabletas en un maestro de 100x15mm placa de Petri y se vierte la solución de PDMS en el plato. </li><li> Cubra el recipiente y colóquelo en un recipiente al vacío durante 15 minutos para eliminar las burbujas. Después de 15 minutos tomar la placa de Petri y para quitar cualquier exceso de burbujas de aire que sopla suavemente sobre la superficie. </li><li> Colocar la placa de Petri en un horno durante 1 hora a 70 ° C. Retirar el plato y cortar las cámaras de microfluidos con una cuchilla afilada. </li></ol> 4. Montaje del dispositivo en el microscopio <ol><li> Encienda la fuente de luz para microscopio invertido y el calentador de hasta 37 º C. Fije el tubo a una jeringa de 10 ml y llenar con agua destilada tal que no hay burbujas. Coloque la jeringa en la bomba de jeringa y caudal establecido para inducir una pared de SS 1 dinas / cm 2. La tensión de cizallamiento (τ w) generado a lo largo de la línea central del canal se aproxima utilizando el estándarecuación para una cámara de flujo de placas paralelas: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="Ecuación 2" /> donde μ es la viscosidad del medio, Q es el caudal volumétrico, h es la altura del canal, y w es la anchura del canal. Nota: puesto que los canales son de anchura finita la real τ w variará con w en función del canal relación de aspecto, y las mediciones se evitan en el 25% más cercana de las paredes laterales. 1,7 </li><li> Coloque PDMS cámara en agua y utilizar una micropipeta 100μl para eliminar el aire de los canales individuales. Conecte el adaptador de vacío a la cámara de asegurarse de que la válvula está desactivado. </li><li> Colocar placa de Petri con monocapa AHCE sobre el objetivo. Coloque la cámara de PDMS sobre la placa de Petri y con cuidado lo establecido en la monocapa AHCE tiempo que se garantiza que no se formen burbujas de aire entre el dispositivo y la monocapa. Gire la válvula de modo que el vacío está activado y la cámara está bien sujeto. </li&gt; <li> Cortar 19 agujas de calibre romos tal que hay sólo 5 mm de izquierda de metal. Llene el depósito de plástico con amortiguador y poner en PDMS entrada de la cámara. Repetir para el número adecuado de canales a ser utilizados. Conecte el tubo de las bombas de jeringa para que las salidas de los canales de PDMS. </li></ol> 5. Ensayo de adhesión de los monocitos bajo una tensión cortante <ol><li> Suspender células THP-1 a 2x10 6 células / ml en HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + HSA + 0,1%. Activar células THP-1 por incubación con factor-1 de derivados del estroma (SDF-1, 50 mg / ml) durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Encienda bomba de jeringa para establecer el flujo, a continuación, añadir 50 l de suspensión de células al depósito sin introducir burbujas de aire. Una vez que el flujo está totalmente desarrollado, comienzan la adquisición de datos. </li><li> Ejecutar durante 5 minutos a velocidad de flujo apropiado, la adición de tampón para el depósito si la solución está baja. Continúa fluyendo de búfer en los canales para vaciar las células no consolidados en la corriente de flujo. </li></ol> 6. Adquisición de Datos y Análisis <ol><li> Adquirir secuencias digitales de imagen en 3 fotogramas por segundo para 2 minutos después de flujo completamente desarrollado a lo largo del eje longitudinal del canal en 3 sitios en el canal, teniendo cuidado de no grabar inmediatamente después de la entrada o antes de los puertos de salida o en el 25% más cercana al lado paredes. </li><li> Cuente el número de células detenidas por campo mediante la identificación de su fase brillante aparición en el mismo plano focal que la monocapa. </li><li> Detención Firma célula se define por el movimiento &lt;diámetro ½ celular en 10 s. Datos promedio de más de 3 campos al azar por canal y cuantificar el uso de software ImageJ. </li></ol> 7. Los resultados representativos Aunque el endotelio vascular está expuesta de manera uniforme a los agonistas que contribuyen a la inflamación sistémica, la aterosclerosis es una enfermedad focal que se desarrolla preferentemente en los lugares de la perturbación del flujo en las arterias, lo que implica la heterogeneidad espacial de la función endotelial. 8 </sup&gt; circulantes de mediadores inflamatorios como el TNF-α están elevados en el suero humano en el estrés metabólico y se correlacionan con la función endotelial. 9, 10 de TNF-α induce una respuesta bien caracterizado en la CE, que incluye la regulación de las moléculas de adhesión celular (CAM , por ejemplo, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) y quimiocinas que reclutan a los monocitos de la circulación, un sello distintivo de la lesión aterosclerótica temprana 11 Hemodinámica es un importante regulador de fenotipo inflamatorio endotelial 12 de alta tensión cortante de magnitud (HSS..; por ejemplo, 15 dinas / cm 2) o el estrés de corte pulsátil (PSS, por ejemplo, 15 ± 5 dinas / cm 2) asociados con los sitios de la resistencia a la aterosclerosis en las arterias descendente de TNF-α regulan las respuestas inducidas. Por el contrario, baja magnitud esfuerzo cortante (LSS, por ejemplo, 2 dinas / cm 2) o de corte oscilatorio (OSS, por ejemplo, 0 ± 5 dinas / cm 2), características de los sitios susceptibles en vivo, exacerban citocinasne inducida por la inflamación. 13, 14 dispositivos de microfluidos Nuestros PDMS proporcionar una plataforma para la realización de estudios sobre el mecanismo para poner a prueba hipótesis relacionadas con la superposición de estrés metabólico con factores hidrodinámicos en la regulación de la función endotelial y de la patología. La utilidad y versatilidad del método está ampliamente ilustrado a través de los siguientes resultados representativos. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. El esfuerzo cortante diferente THP-1 modula la adhesión celular a TNF-alfa monocapas endoteliales inflamadas. Estos datos fueron adquiridos utilizando el protocolo descrito anteriormente detallada y documentada en el video. Monocapas AHCE fueron expuestas simultáneamente a una dosis baja de la citoquina inflamatoria TNF-α (0,5 ng / ml, ~ 50 CE para la VCAM-1 sobre regulación) y, o bien HSS (15 dinas / cm 2) o OSS (0 ± 5 dinas / cm 2, 1 Hz) en un CSD personalizada durante 4 horas de la forma descritacama en el protocolo detallado. THP-1 detención celular se cuantificó bajo flujo cortante en una cámara de flujo de PDMS. Esta línea celular que imita el fenotipo de los monocitos humanos fue elegido por su reproducibilidad y facilidad de uso. HSS atenuada la respuesta inflamatoria en comparación con el software libre, lo que resulta en el arresto de disminución de células THP-1. Los datos fueron analizados mediante la t de Student-test y se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de DeVerse et al. 5 Los siguientes datos demuestran la versatilidad de nuestro enfoque, usando ejemplos de nuestro trabajo publicado. Salidas desde el protocolo anterior se indican en su caso. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La modulación de citoquinas inducida por la expresión de VCAM-1 y el reclutamiento de monocitos en un gradiente de esfuerzo cortante. A) monocapas AHCE fueron estimuladas con TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h bajo flow en un VMMC diseñado en base a la teoría de flujo de Hele-Shaw. 15 Una disminución lineal en magnitud SS a lo largo de la línea central del canal se logra mediante el diseño de las paredes laterales de la cámara para coincidir con las líneas de corriente de un flujo de estancamiento de dos dimensiones y la configuración del extremo del canal para que coincida con las líneas de iso-potenciales. La tensión de cizallamiento (τ w) generado a lo largo de la línea central de este canal a una distancia axial de la entrada (x) viene dada por: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="Ecuación 3" /> donde μ es la viscosidad del medio, Q es el caudal volumétrico, h es la altura del canal, w 1 es la anchura del canal de entrada, y L es la longitud total del canal. Q fue elegido para generar un gradiente en magnitud SS de 16 dinas / cm 2 en la entrada a 0 en el punto de estancamiento &quot;, un&quot; justo proximal a la outlet. B)-C) VCAM-1 de expresión se midió in situ por microscopía de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos conjugados con los puntos cuánticos y presentada como la intensidad de fluorescencia porcentaje mediana (MFI) de control de unstimulated estática. SS no modular el nivel basal de VCAM-1, que es baja en AHCE no estimulada (triángulos de color gris). Sin embargo, la expresión de VCAM-1 aumentó en relación con el TNF-α en magnitudes LSS, alcanzando un máximo de ~ 2 dinas / cm 2 y volver a la línea de base de TNF-α o por debajo de las magnitudes de corte&gt; 5 dinas / cm 2 (cuadrados negros). D) Los monocitos (10 6 / ml) fueron perfundidos menos 2 dinas / cm 2 durante 5 min en los canales de flujo paralelo sobre monocapas acondicionan previamente como en A). Reclutamiento de monocitos al endotelio cuantitativamente correlacionada con la VCAM-1 de expresión, de una magnitud dada esfuerzo cortante. En particular, la capacidad para sondear la VCAM-1 de expresión y el reclutamiento de monocitos con buena resolución espacial en una monolayeR reveló cambios significativos en un rango estrecho en magnitud SS que no se apreciará por la aplicación de sólo unos pocos valores discretos de cizallamiento en experimentos separados. Los datos fueron analizados por ANOVA de medidas repetidas y las diferencias evaluadas por Newman-Keuls post-test, * P &lt;0,05 TNF-α en condiciones estáticas. Los datos son la media ± SEM de 3-6 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de Zou et al. 2 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Lipoproteínas ricas en triglicéridos (TGRL) modulan la inflamación inducida por citoquinas en proporción a los niveles de triglicéridos en suero de donantes y la expresión de VCAM-1. Monocapas AHCE fueron estimuladas con TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h simultáneamente con TGRL (10 mg / dl ApoB) aisladas de seres humanos después de una comida alta en grasas en la cultura estática. A) la expresión de VCAM-1 se midió por separado en suspensión CE, por citometría de flujoy adhesión de los monocitos cuantificaron utilizando un VMMC como se describe en el protocolo detallado. Los datos se presentan como% de cambio del TNF-α. Detención monocitos varió en proporción directa a endotelial VCAM-1 de expresión, que aumentó directamente con el nivel de triglicéridos en suero de donantes. B) Monocitos detención para un subconjunto de pro-inflamatorias donantes se derogó en la presencia de un VCAM-1 anticuerpo bloqueante. La significancia fue determinado por la t de Student pareado de la prueba, media ± SEM de 3-5 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de Wang et al. 4

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P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha.">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li><li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal.">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. 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No hay conflictos de interés declarado.

Se describe la utilización de dispositivos de microfluidos PDMS para la evaluación en el chip del fenotipo inflamatorio endotelial a través de la formación de imágenes en tiempo real de expresión CAM y adhesión de los monocitos. Una gran ventaja de nuestro enfoque reside en la capacidad de cuantificar los resultados asociados con la disfunción endotelial en las células expuestas a los mediadores inflamatorios como citocinas y lípidos de la dieta bajo condiciones hidrodinámicas definidos que reflejan la tensi?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 100 x 20 mm platos de Petri </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> El etanol 95% </td><td> Merck Chemicals </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 a 031 CV </td></tr><tr><td> El colágeno tipo I Cola de Rata Derivado </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> Las células endoteliales de aorta </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico solución </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> BulletKit endotelial </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Endoteliales basales medios de comunicación-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 ml Jeringas </td><td> BD Falcon </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Poliuretano tubo </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz, de 15 medios de comunicación </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 base de elastómero de silicona </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 de elastómero de silicona Agente de Curado </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 Fotoresinas Wafer Maestro </td><td> UC Davis Pan Lab </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse TE200 microscopio invertido </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE200 </td></tr><tr><td> Bomba de jeringa </td><td> Aparato de Harvard </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> Calibre 19 con aguja hipodérmica </td><td> Kendall </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 línea celular de monocitos </td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td> HBSS (Hanks solución salina tamponada) con Ca 2 + / Mg 2 + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Factor de derivados del estroma - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 350-SN-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10 a 040 CV </td></tr><tr><td> La albúmina humana (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos específicos y equipos.

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

La aterogénesis es potenciada por las alteraciones metabólicas que contribuyen a un estado de inflamación sistémica que resulta en la disfunción endotelial. Sin embargo, los primeros cambios funcionales en el endotelio que significan un nivel individual de riesgo no están directamente evaluados clínicamente para ayudar a guiar la estrategia terapéutica. Por otra parte, la regulación de la inflamación mediante la hemodinámica local contribuye a la distribución espacial no aleatoria de la aterosclerosis, pero los mecanismos son difíciles de delimitar en vivo. Se describe un enfoque basado en el laboratorio-en-un-chip a la perturbación determinar cuantitativamente metabólica de eventos inflamatorios en las células endoteliales (CE) y los monocitos bajo condiciones de flujo precisos. Los métodos estándar de la litografía blanda se utilizan para microfabricate vasculares cámaras miméticos de microfluidos (VMMC), que se enlazan directamente a los cultivos de monocapas de la CE. 1 Estos dispositivos tienen la ventaja de utilizar pequeñas cantidades de reactivos, mientras queproporcionar una plataforma para formación de imágenes directamente los sucesos inflamatorios en la membrana de CE expuesto a un campo de cizallamiento bien definido. Se han aplicado con éxito estos dispositivos para investigar citoquinas, 2 lípido-3, 4 y RAGE-5 inducida por la inflamación en humana CE aórtico (AHCE). Aquí se documenta el uso de la VMMC a la celda de ensayo de monocítica (THP-1) a la rodadura y la detención en monocapas AHCE que están condicionados en las características diferenciales de corte y se activa por la citoquina inflamatoria TNF-α. Estudios como estos son proporcionar una visión mecanicista en atherosusceptibility en caso de factores de riesgo metabólicos.

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On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Cámaras de flujo de microfluidos grabadas por fotolitografía y fabricada a partir de PDMS se aplican para investigar los resultados funcionales asociados con la disfunción CE y la inflamación. En un experimento representativo, la capacidad de esfuerzo cortante diferencial para modular la adhesión celular monocítica a citoquina activado monocapas CE se demuestra.

On-Chip fenotipificación inflamatoria endotelial

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K vistas.  University of California, Davis. Cámaras de flujo de microfluidos grabadas por fotolitografía y fabricada a partir de PDMS se aplican para investigar los resultados funcionales asociados con la disfunción CE y la inflamación. En un experimento representativo, la capacidad de esfuerzo cortante diferencial para modular la adhesión celular monocítica a citoquina activado monocapas CE se demuestra.

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Investigación

Bioingeniería

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree en el chip tomográfica Microscopía empleo de multi-ángulo de iluminación y píxeles de super-resolución

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

Ferromagnético Bare Metal stent para la captura de la célula endotelial y Retención

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Fenotipado de tensión de levadura de alto rendimiento con secuenciación de ARN basada en gotas

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

Bioimpresión directa de esferoides multicelulares de mama 3D en redes endoteliales

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

Caracterización de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC) de sangre periférica porcina

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...